Четвертичная структура ДНК. Хромосомы

4. Природа генетического материала 119

длиной лишь 2·10 4 Å при диаметре около 8·10 3 Å. Следовательно, ДНК может существовать в клетке лишь в высокоупорядоченном (конденсированном) состоянии. Хотя в прокариотических клетках нет белков гистонов, в них тем не менее содержатся некоторые белки, образующие комплексы с ДНК. При электронной микроскопии разрушенных определенным образом клеток Е. coli можно видеть, что ДНК собрана в «бусины», по величине очень близкие нуклеосомам эукариот (рис. 4.21). Эти

120 Организация и передача генетического материала

бусины очень лабильны, что указывает на то, что взаимодействие между ДНК и белками в клетках Е. coli много слабее, чем между ДНК и гистонами эукариот. Характер иерархической конденсации хромосомы Е. coli не вполне понятен, но хромосома в целом может быть выделена в виде компактной структуры, называемой нуклеоидом.

Не вся ДНК эукариотических клеток находится в ядрах клеток. Митохондрии и недифференцированные хлоропласты растений, так называемые пластиды, представляют собой самореплицирующиеся органеллы и содержат собственные кольцевые молекулы ДНК. Эти молекулы очень невелики и кодируют ограниченное количество информации, необходимой для осуществления органеллами их функций. Так же как и хромосомы прокариот, они не связаны с гистонами и образуют внутри органелл нуклеоиды.

© Разин С.В.

Пространственная организация ДНК

С.В. Разин

Сергей Владимирович Разин, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
заведующий лабораторией структурно-функциональной организации хромосом в Институте биологии гена РАН,
профессор кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Еще в начале прошлого века благодаря использованию чисто генетических методов выяснилось, что гены линейно расположены на хромосомах. С тех пор большинство исследователей рассматривают геном как цепь последовательно расположенных генов и межгенных участков, включающих различные регуляторные и другие (казалось бы незначимые) последовательности. Такой стереотип мышления отражается, в частности, в том, что расстояния между генами или другими участками ДНК обычно указывают в тысячах нуклеотидных пар, имея в виду расстояния вдоль молекулы ДНК.

Хотя это вполне корректно, но такое представление о линейности генома заключает в себе определенные опасности. Дело в том, что в ядре эукариотической клетки геном упакован чрезвычайно сложно. В результате последовательности ДНК, в том числе и гены, отстоящие друг от друга на десятки или сотни тысяч нуклеотидных пар, а иногда и вообще расположенные в разных хромосомах, в трехмерном пространстве оказываются в непосредственной близости. Это обеспечивает взаимодействие белковых комплексов, связанных с удаленными (если считать вдоль молекулы ДНК) регуляторными элементами. Такие взаимодействия значительно расширяют возможности работы различных регуляторных систем в геноме эукариотической клетки. В последние годы получено несколько принципиально новых наблюдений, существенно повысивших интерес к пространственной организации ДНК в ядре. Мы попытаемся суммировать современные достижения в этой области.

Упаковка ДНК в ядре

В средней эукариотической клетке общая протяженность геномной ДНК составляет около 2 м, диаметр ее ядра всего ~10-20 мкм. При этом совокупность генов, работающих в данной клетке, должна быть доступна для РНК-полимераз и транскрипционных факторов, а вся ДНК в делящихся клетках должна реплицироваться.

Сегодня известно, что упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки осуществляется в несколько этапов (рис.1). Сначала нить ДНК укладывается в нуклеосомы, при этом ее длина уменьшается в шесть-семь раз. Затем нуклеосомная нить складывается в так называемую 30 нм фибриллу (соленоид или зигзагообразную нить), что обеспечивает дополнительную компактизацию в 40 раз. Далее фибрилла организуется в большие (50 и более тысяч пар нуклеотидов) петли, концы которых закрепляются на белковом скелете ядра (его часто называют ядерным матриксом). На этом этапе линейные размеры ДНК сокращаются в 700 раз . Существуют и следующие уровни компактизации ДНК, информация о которых в настоящее время весьма скудна и противоречива.

Рис. 1. Уровни упаковки ДНК в ядре эукариотической клетки.

Пока речь шла лишь об упаковке одной протяженной молекулы ДНК. В первом приближении таковой можно считать ДНК одной хромосомы. Однако геном эукариотической клетки разделен на несколько хромосом. Например, в клетках любимого объекта генетиков - плодовой мушки дрозофилы - имеется четыре пары хромосом (в клетках человека их 46). Индивидуальные хромосомы можно увидеть под микроскопом только во время митоза. На остальных фазах клеточного цикла они не видны, и ядро клетки представляется относительно гомогенным. В течение многих лет молекулярных биологов интересовал вопрос, занимают ли отдельные хромосомы ограниченные пространства внутри ядра или же при декомпактизации хромосом ДНК каждой из них распределяется по всему ядру, неизбежно перемешиваясь с ДНК других хромосом.

Рис. 2. Окраска хромосомных территорий.

А - ДНК метафазных хромосом человека. Б - ДНК интерфазного ядра. В - ДНК метафазных хромосом (синий цвет) после гибридизации с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосому 18 (красный цвет) и хромосому 19 (зеленый цвет); показаны два гомолога соответствующей хромосомы. Г - результаты гибридизации ДНК интерфазных ядер с хромосом-специфичными пробами, узнающими хромосомы 18 и 19. Восемь секций ядра сделаны с помощью конфокального микроскопа; синим окрашена вся ядерная ДНК (как на рис.Б).

Рис. 3. Двумерная и трехмерная модели ядра, показывающие расположение хромосомных территорий .

Взаимодействие удаленных регуляторных элементов

Упаковка ДНК в иерархические хроматиновые структуры принципиально важна для физического расстояния между регуляторными последовательностями и их ориентации в пространстве. А эти последовательности всегда служат площадками связывания регуляторных белков. Уже организация ДНК в нуклеосомы может сделать эти площадки недоступными для белковых факторов, либо ориентировать их так, что посаженные на них белковые комплексы в силу чисто стерических причин (например, направленности в противоположные стороны) не смогут взаимодействовать друг с другом. А при формировании фибрилл возможности подавления либо активации тех или иных регуляторных систем возрастают. Однако расположение нуклеосом на ДНК достаточно динамично. Обратимые изменения в их структуре и степени конденсации хроматина (в частности, переход от развернутой нуклеосомной нити к 30 нм фибрилле и более компактным гетерохроматиновым структурам) составляют наиболее изученную часть эпигенетических механизмов.

Эти механизмы мы не будем обсуждать, а остановимся на следующем уровне упаковки ДНК в хроматине, а именно на протяженных петлях ДНК (рис.1). Их можно увидеть при электронной микроскопии метафазных хромосом и интерфазных ядер, из которых были удалены гистоны. Наличие в интерфазных ядрах топологически замкнутых петель ДНК продемонстрировано и с помощью биохимических методов .

Прикрепленные к ядерному матриксу петли ДНК заинтересовали специалистов прежде всего потому, что по своим размерам они могли бы соответствовать функциональным единицам генома. Для проверки этого предположения требовалось изучить специфичность организации ДНК в петли. Во-первых, установить, одинаково ли разделение генома на петли во всех клетках. Если это предположение верно, то одни фрагменты генома всегда должны находиться в основаниях петель ДНК, а другие - в самих петлях. Во-вторых, выяснить, имеются ли некие особые последовательности ДНК, ответственные за "заякоривание" петель на белковом матриксе ядра.

Метод разрезания генома

За последние 30 лет предложено несколько методов картирования участков прикрепления петель ДНК к ядерному матриксу (хромосомному остову). Хотя эти методы различаются в деталях, их можно разделить на две принципиально различающиеся группы. Первая основана на выделении так называемой "прилежащей к ядерному матриксу ДНК" (т.е. находящейся в основаниях петель) и фракции петель ДНК, которая отщепляется от ядерного матрикса при ограниченной обработке ядер ферментом нуклеазой (рис.4). Предпочтительное присутствие исследуемого фрагмента ДНК в прилежащей ядерному матриксу фракции, полученной после достаточно интенсивной нуклеазной обработки, позволяет говорить о том, что он прикреплен к ядерному матриксу. Вторая группа методов направлена на изучение специфичности последовательностей ДНК, взаимодействующих с ядерным матриксом. В основе всех методов лежит избирательное связывание in vitro (т.е. в пробирке) фрагментов клонированной ДНК с изолированным ядерным матриксом. Однако результаты, полученные с помощью двух методических подходов, оказались достаточно противоречивыми .

Рис. 4. Схема установления позиций генов в петлях ДНК.

А - нуклеоид, полученный после экстракции гистонов из ядер, не обработанных нуклеазой; одна из петель ДНК содержит три гена: "a" находится в проксимальной (по отношению к ядерному матриксу) части петли, "b" занимает промежуточное положение, и "c" - в дистальной части;

Б - после обработки ядер нуклеазой образуются примерно два разрыва на петлю; фрагменты ДНК, находящиеся в основаниях петель (внутри пунктирного круга), прикреплены к ядерному матриксу. После дифференциального центрифугирования фрагменты разделяются, и в прикрепленной к ядерному матриксу ДНК остаются гены "a" и "b";

В - после дополнительной обработки нуклеазой остается только ген "а".

Существует целый ряд ингибиторов ДНК-топоизомеразы II (в нашем случае VM-26), которые останавливают реакцию на стадии промежуточного комплекса фермент-ДНК. (Интересно, что большинство из них используются в качестве противоопухолевых агентов.) При этом каждая из субъединиц фермента остается ковалентно связанной с 5ў -концом разорванной цепи ДНК. Если такие блокированные комплексы обработать денатурирующим агентом, после чего разрушить фермент, то получится препарат ДНК, разрезанный на фрагменты в местах контакта ДНК с ферментом (рис.5). Если бы топоизомераза II находилась только в ядерном матриксе, то простая обработка живых клеток ее ингибиторами разрезала бы весь геном по участкам прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Однако задача осложняется тем, что этот фермент в растворимой форме присутствует в нуклеоплазме и может вносить разрывы в любом месте (если окажется рядом с ДНК в момент обработки клеток ингибитором). Наиболее вероятными точками разрывов будут свободные от нуклеосом участки, наиболее чувствительные к ДНК-нуклеазе (ДНКазе I). Чтобы исключить возможность разрывов вне интересующих нас участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу, мы экстрагировали растворимый фермент, а заодно и гистоны, обрабатывая ядра 2M NaCl (рис.4). Полученные так называемые нуклеоиды обрабатывали ингибиторами ДНК-топоизомеразы II . Так нам удалось разрезать весь геном на отдельные петли и их олигомеры.

Рис. 5. Схема метода картирования петель ДНК:

А - реакция, катализируемая ДНК-топоизомеразой II, и механизм разрезания ДНК при ингибировании сшивающей активности фермента VM-26 и другими "топоизомеразными ядами";

Б - разрезание геномной ДНК на индивидуальные петли. После удаления гистонов развернутые петли ДНК все еще прикреплены к ядерному матриксу (желтые кружки), содержащему ДНК-топоизомеразу II (фиолетовые кружки). Нуклеоиды инкубируют в среде с VM-26, после чего лизируют додецилсульфатом натрия (SDS). В местах прикрепления петель к ядерному матриксу топоизомераза II разрезает ДНК;

В - в петлях ДНК, обработанных рестриктазой Sfi I, появляются разрывы. Фрагмент Sfi I-Sfi I (показан синим цветом) можно идентифицировать с помощью гибридизации с пробой, комплементарной одному из концов полноразмерного рестриктного фрагмента (синяя стрелка). Справа тот же участок генома после дополнительного разрыва, вызванного топоизомеразой II (фиолетовый кружок). Размер укороченного фрагмента равен расстоянию от участка расщепления ДНК-рестриктазой Sfi I до участка расщепления ее топоизомеразой II;

Г - типичная картина результата электрофореза. На всех дорожках виден полноразмерный Sfi I-Sfi I фрагмент ДНК. В дорожках, содержащих ДНК из нуклеоидов, обработанных высокими концентрациями VM-26, появляется дополнительный (Sfi I-Тopo II) фрагмент, который свидетельствует, что внутри изучаемого фрагмента ДНК находится участок прикрепления к ядерному матриксу.

Принцип этого метода заключается в том, что после внесения в ДНК разрывов тем или иным агентом (в нашем случае - ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса) препарат дополнительно разрезают избранной рестриктазой. После разделения фрагментов с помощью электрофореза и переноса их на нитроцеллюлозный фильтр проводят гибридизацию с пробой, комплементарной концу вырезанного фрагмента, внутри которого может находиться дополнительный разрыв. Если такого разрыва нет, то после гибридизации получится полноразмерный фрагмент. Но если внутри этого фрагмента ДНК была разрезана топоизомеразой II ядерного матрикса или другим ферментом, фрагмент будет более коротким, и длина его равна расстоянию от участка расщепления ДНК рестриктазой до участка расщепления ДНК изучаемым агентом (рис.5). При работе с петлями, вырезанными ДНК-топоизомеразой II, основная трудность заключается в необходимости разделить по размеру очень длинные фрагменты ДНК. Эту проблему можно решить, используя электрофорез в пульсирующем поле, который позволяет разделить фрагменты ДНК с размерами от нескольких тысяч до нескольких миллионов нуклеотидных пар .

Карта организации в петли-домены гена дистрофина человека

Мы с успехом использовали вышеописанный метод для картирования границ петель в ряде областей генома человека и дрозофилы. После этого была поставлена масштабная задача - построить карту организации в петли-домены самого протяженного из известных генов - гена дистрофина человека. В этом гене, расположенном на Х-хромосоме, около 2500 тыс. нуклеотидных пар, а размер его мРНК составляет всего 14 тыс. нуклеотидных пар. Иначе говоря, более 99% от общей протяженности гена занимают некодирующие последовательности (интроны). В гене дистрофина часто происходят различные перестройки, некоторые из которых приводят к тяжелым наследственным заболеваниям - мышечным дистрофиям .

Рис. 6. Карта организации в петли гена дистрофина человека.

Вверху - схема расположения участков и областей прикрепления ДНК к ядерному матриксу (горизонтальные линии, обозначенные номерами 1-8) в границах гена дистрофина. Вертикальные стрелки (латинские буквы A-I) указывают на расположение участков расщепления; горизонтальные - на позиции гибридизационных проб.

Внизу - схема визуализации уникальных фрагментов ДНК на препаратах нуклеоидов. После экстракции из ядер гистонов петли ДНК расправляются и образуют корону вокруг ядерного матрикса (a). Препараты гибридизуют с пробами, содержащими биотин (жирная полоса на схеме б). Такую пробу можно увидеть после окраски антителами, связанными с флуоресцентным красителем (черные кружочки на схеме в).

Петли ДНК под микроскопом

Экспериментальный подход, использованный нами для картировании петель ДНК, основан на ряде логических предпосылок, вытекающих из радиально-петлевой модели строения хромосомы. До недавнего времени не было прямых доказательств того, что петли ДНК, картированные с помощью разных методов, именно те, которые можно видеть на цитологических препаратах. Среди множества переплетающихся петель ДНК, наблюдаемых под электронным микроскопом, практически невозможно идентифицировать петлю как фрагмент генома, интересующий исследователя. Однако это возможно при анализе петель с более низким разрешением.

Рис. 7. Микрофотографии результатов гибридизации in situ с препаратами ядерных гало (a) с фрагментом человеческого генома - петли ДНК, картированной в гене дистрофина. Эта петля ограничена областями прикрепления к ядерному матриксу 7 и 8. Гибридизация без конкурентной ДНК (б) и в присутствии избытка немеченной фракции повторяющихся последовательностей человеческой ДНК (в).

В ходе реализации программы по секвенированию генома человека в разных лабораториях клонировали тысячи протяженных (100-300 тыс. нуклеотидных пар) фрагментов ДНК человека. Большинство клонов систематизировали соответственно позициям клонированных фрагментов ДНК в геноме человека. Существует целый ряд научных центров, в которых можно приобрести интересующий клон. Мы взяли клонированный фрагмент человеческой ДНК, представляющий картированную нами в гене дистрофина петлю ДНК, ограниченную участками прикрепления 7 и 8 (см. рис.6). После гибридизации этого фрагмента с препаратами ядерных гало выявляется множество сигналов, распределенных по всему полю (рис.7, б). Это связано с тем, что в ДНК высших эукариот, в том числе и человека, присутствует множество повторяющихся последовательностей, распределенных по всему геному.

Имеющиеся в нашей пробе повторы гибридизуются со всеми комплементарными последовательностями. Понятно, что результаты такого эксперимента не поддаются интерпретации. К счастью, сигналы от гибридизации повторяющихся последовательностей можно подавить. Для этого мы провели гибридизацию в присутствии избытка немеченой фракции повторяющихся последовательностей ДНК человека и увидели петли ДНК, прикрепленные к ядерному матриксу (рис.7, в). Все они имели одинаковый размер (в пределах погрешности измерений), соответствующий длине фрагмента ДНК, картированного в экспериментах по вырезанию петель ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса .

Значение этого результата выходит за рамки простого подтверждения правильности построенной нами карты доменной организации гена дистрофина. Впервые в мире мы показали, что биохимический метод, основанный на радиальной модели строения хромосомы, действительно позволяет картировать петли ДНК, наблюдаемые на цитологических препаратах. Это подтверждает и радиальную модель строения хромосомы, на основании которой разработан наш метод вырезания петель. Далее, возможность наблюдать одинаковые петли ДНК при анализе ряда препаратов ядерных гало подтверждает тот факт, что ДНК организована в петли статично, т.е. во всех клетках к ядерному матриксу прикреплены одни и те же фрагменты ДНК, а участки между ними образуют петли. Мы поставили эксперимент на активно делящихся клетках. Коль скоро во всех клетках выявлены одинаковые петли ДНК, можно утверждать, что специфическая организация ДНК в петли, разделенные зонами прикрепления, сохраняется в ряду клеточных делений. Это обстоятельство чрезвычайно важно, поскольку позволяет рассматривать такую организацию ДНК как один из эпигенетических механизмов. Действительно, при образовании петель могут фиксироваться позиции различных регуляторных элементов и их мишеней, способствуя их взаимодействию либо, наоборот, исключая его.

Петли ДНК, хромосомные перестройки и эволюция генома

Как мы уже говорили, горячие точки рекомбинации гена дистрофина находятся в сегментах, прикрепленных к ядерному матриксу. Дополнительные исследования показали, что к ядерному матриксу прикреплены и горячие точки рекомбинации, присутствующие в ряде других генов, в частности тех, рекомбинации которых ассоциированы с развитием лейкозов . Трудно поверить, чтобы это было просто случайным совпадением. Скорее всего, именно постоянный контакт ДНК с топоизомеразой служит причиной возникновения "горячих точек" хромосомных перестроек. Топоизомераза II может прямо участвовать в незаконной рекомбинации. Еще более вероятно, что внесенные ею двунитевые разрывы в ДНК при определенных условиях могут стимулировать неточное восстановление этих повреждений.

Известно, что репарация двунитевых разрывов в ДНК высших эукариот нередко приводит к различным рекомбинационным событиям. На возможную роль топоизомеразы II как индуктора хромосомных перестроек указывают многочисленные данные о том, что использование ингибиторов этого фермента в химиотерапии опухолей нередко вызывает вторичные лейкозы . Клетки этих лейкозов характеризуются различными крупномасштабными хромосомными изменениями, наиболее частыми в участках расщепления ДНК-топоизомеразой II . Важно отметить, что участки прикрепления петель на молекуле ДНК располагаются достаточно далеко друг от друга, но внутри ядра они могут оказаться в непосредственной близости. Незаконная рекомбинация между такими участками будет приводить к утрате либо перемещению протяженных участков генома, что, в свою очередь, может быть важным фактором эволюции генома .

Литература

1. Getzenberg R.H., Pienta K.J., Ward W.S., Coffey D.S. // Journal of Cellular Biochemistry. 1991. V.47. P.289-299.

2. Cremer T., Kurz A., Zirbel R., Dietzel S. et al. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.777-792.

3. Peterson C.L., Laniel M.A. // Curr. Biol. 2004. V.14. P.R546-551.

4. Razin S., Gromova I.I., Iarovaia O.V. // International Review of Cytology. 1995. V.162B. P.405-448.

5. Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O. et al. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1993. V.58. P.25-35.

6. Nedospasov S.A., Georgiev G.P. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V.92. P.532-539.

7. Schwartz D.C., Cantor C.R. // Cell. 1984. V.37. P.67-75.

8. Hoffman E.P., Schwartz L. // Mol. Aspects Med. 1991. V.12. P.175-194.

9. Iarovaia O.V., Bystritskiy A., Ravcheev D., Hancock R. et al. // Nucl. Acids. Res. 2004. V.32. P.2079-2086.

10. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K. et al. // Nucl. Acids Res. 1986. V.14. P.8189-8207.

11. Iarovaia O.V., Shkumatov P., Razin S.V. // J. Cell. Sci. 2004. V.117. P.4583-4590.

12. Super H.J., McCabe N.R., Thirman M.J., Larson R.A. et al. // Blood. 1993. V.82. P.3705-3711.

13. Zhang Y., Strissel P., Strick R., Chen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. P.3070-3075.

14. Razin S.V. // Crit. Rev. Eukar. Gene Exp. 1999. V.9. P.279-283.

Типы метафазных хромосом, их строение. Различают четыре типа строения хромосом:телоцентрические (палочковидные хромосомы с центромерой, расположенной на проксимальном конце); акроцентрические (палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом);

субметацентрические (с плечами неравной длины, напоминающие по форме букву L); метацентрические (V-образные хромосомы, обладающие плечами равной длины). Тип хромосом является постоянным для каждой гомологичной хромосомы и может быть постоянным у всех представителей одного вида или рода

Хромосомы синтетически неактивны. Строение хромосом лучше всего изучать

в момент их наибольшей конденсации, т.е. в метафазе и начале анафазы митоза.

Каждая хромосома в метафазе митоза состоит из двух хроматид,

образовавшихся в результате редупликации, и соединенных центромерой

(первичной перетяжкой). В центральной части центромеры находятся кинетохоры, к которым во время митоза прикрепляются микротрубочки нитей веретена. В анафазе хроматиды отделены друг от друга. Из них образуются дочерние хромосомы, содержащие одинаковую генетическую информацию. Центромера делит хромосому на два плеча. Хромосомы с равными плечами называют равноплечими или метацентрическими, с плечами неодинаковой длины - неравноплечими - субметацентрическими, с одним коротким и вторым почти незаметным - палочковидными или акроцентрическими (рис. 48).

Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку, отделяющую спутник.

Вторичные перетяжки называют ядрышковыми организаторами. В них в интерфазе

происходит образование ядрышка. В ядрышковых организаторах находится ДНК,отвечающая за синтез р-РНК. Плечи хромосом оканчиваются участками,

называемыми теломерами, не способными соединяться с другими хромосомами.

Число, размер и форма хромосом в наборе у разных видов могут варьировать.

Совокупность признаков хромосомного набора называют кариотипом

Хромосомный набор специфичен и постоянен для особей каждого вида. У

человека 46 хромосом, у мыши - 40 хромосом и т.д.В соматических клетках, имеющих диплоидный набор хромосом, хромосомы парные. Их называют гомологичными. Одна хромосома в паре происходит от материнского организма, другая - от отцовского. Изменения в структуре хромосом или в их числе возникают в результате мутаций. Каждая пара хромосом в наборе индивидуальна. Хромосомы из разных пар называют негомологичными.

глотку.В цитоплазме есть многочисленные пищеварительные вакуоли, на заднем конце тела находится порошица. Есть две сократительные вакуоли. К крупному макронуклеусу вплотную прилегает микронуклеус. Инфузории способны инцистироваться. Сами инфузории и их цисты могут длительное время сохранять жизнеспособность вне организма хозяина. В водопроводной воде инфузории выживают до 7 суток. Цисты остаются живыми во влажной среде (при комнатной температуре) до двух месяцев. Балантидий локализуется в толстом (иногда в тонком) кишечнике у человека, вызывая изъязвления его стенок. Клинически это тяжелое заболевание выражается в кровавом поносе, коликах, лихорадке и мышечной слабости. Основным источником распространения балантидиаза служат свиньи, зараженные балантидиями. Балантидий в кишечнике свиней образуют цисты, которые с фекалиями попадают во внешнюю среду и там сохраняются длительное время. Заражение человека происходит при занесении цист в пищеварительный тракт с грязными руками или пищей.

Часто балантидиазом болеют люди, связанные с работой по уходу за

свиньями или с обработкой свинины. Диагноз ставят при нахождении балантидиев в фекалиях.

Билет 11 Реализация генетической информации в клетке. Регуляция активности генов про- и эукариот. 2. Онтогенез, его периодизация. Морфо-функциональные и генетические особенности половых клеток.

Реализа́ция генети́ческой информа́ции - процесс, происходящий внутри каждой живой клетки , во время которого генетическая информация , записанная в ДНК , воплощается в биологически активных веществах - РНК и белках . Переход генетической инфо рмации от ДНК к РНК и от РНК к белку является универс альным для всех без исключения клеточных организмов. Представление об этом информационном потоке называетсяцентральной догмой молекулярной биологии.Принципиальная схема реализации генетической информации у про- и эукариот.
ПРОКАРИОТЫ. У прокариот синтез белка рибосомой (трансляция ) пространственно не отделен от транскрипции и может происходить еще до завершения синтеза мРНК РНК-полимеразой . Прокариотические мРНК часто поли цистронные , то есть содержат несколько независимых генов .
ЭУКАРИОТЫ. мРНК эукариот синтезируется в виде предшественника, пре-мРНК, претерпевающего затем сложное стадийное созревание - процессинг , включающий присоединение кэп -структуры к 5" -концу молекулы, присоединение нескольких десятков остатков аденина к ее 3" -концу (полиаденилирование ), выщепление незначащих участков - интронов и соединение друг с другом значащих участков - экзонов (сплайсинг ). При этом соединение экзонов одной и той же пре-мРНК может проходить разными способами, приводя к образованию разных зрелых мРНК, и в конечном итоге разных вариантов белка (альтернативный сплайсинг). Только мРНК, успешно прошедшая процессинг, экспортируется из ядра в цитоплазму и вовлекается в трансляцию.

2. Онтогенез - индивидуальное развитие особи - начинается с момента слияния

сперматозоида с яйцеклеткой и образования зиготы, заканчивается смертью.

Внутриутробная форма характерна для млекопитающих и человека. Все

функции зародыша осуществляются за счет организма матери, с помощью

специального органа – плаценты.

Яйцеклетка – крупная неподвижная клетка, обладающая за-па-сом питательных веществ. Размеры женской яйцеклетки составляют 150–170 мкм (гораздо больше мужских сперматозоидов, размер которых 50–70 мкм). Функции питательных веществ различны. Их выполняют:

1) компоненты, нужные для процессов биосинтеза белка (ферменты, рибосомы, м-РНК, т-РНК и их предшественники);

2) специфические регуляторные вещества, которые контролируют все процессы, происходящие с яйцеклеткой, например, фактор дезинтеграции ядерной оболочки

3) желток, в состав которого входят белки, фосфолипиды, различные жиры, минеральные соли. Яйцеклетка обычно имеет шарообразную или слегка вытянутую форму, содержит набор тех типичных органелл, что и любая клетка. Как и другие клетки, яйцеклетка отграничена плазматической мембраной, но снаружи она окружена блестящей оболочкой, состоящей из мукополисахаридов (получила свое название за оптические свойства). Блестящая оболочка покрыта лучистым венцом, или фолликулярной оболочкой, которая представляет собой микроворсинки фолликулярных клеток. Она играет защитную роль, питает яйцеклетку.Яйцеклетка лишена аппарата активного движения. За 4–7 суток она проходит по яйцеводу до полости матки расстояние, которое примерно составляет 10 см. Для яйцеклетки характерна плазматическая сегрегация. Это означает, что после оплодотворения в еще не дробящемся яйце происходит такое равномерное распределение цитоплазмы, что в дальнейшем клетки зачатков будущих тканей получают ее в определенном закономерном количестве.

Похожая информация.

Длина ДНК диплоидного набора хромосом человека составляет примерно 174 см., средняя длина ДНК одной хромосомы – 5 см. В ядре длина одной хромосомы составляет 0,5 – 1 микрон. Такая упаковка двойной спирали ДНК объясняется ее дальнейшей последовательной компактизацией.

Рис. 12. A-, B-, C- и D-формы ДНК

(А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова, 2005, с. 90)

1. Нуклеосомный уровень. Нуклеосома - это ДНК - гистоновый комплекс, который выглядит как частица дисковидной формы диаметром 11 нм. Впервые нуклеосомы были описаны в 1974г. А. Олинс и Д. Олинс . Каждая нуклеосома состоит из белкового кора или октамера и 2 оборотов фрагмента двухцепочечной ДНК (рис.13).

Рис. 13. Модель нуклеосомного кора. Сегмент ДНК (146 пар оснований), обвивает белковый кор, делая вокруг него примерно 2 оборота (1¾). (С. Б. Бокуть и др., 2005, с. 52)

Белковый кор (сердцевина) содержит набор из 4 пар гистоновых белковН2А, Н2В, Н3, Н4. Это самые консервативные белки в любом геноме. Они практически одинаковы у гороха и у человека.

Нуклеосомы связываются участками ДНК (линкерная ДНК) свободными от контакта с белковым кором.

Укладка линкерного участка ДНК (60-80 п.н.) и соединение нуклеосом друг с другом идут с помощью гистона Н1. Молекула этого белка имеет центральную (глобулярную) часть и вытянутые «плечи». Центральная часть прикрепляется к специфическому участку на поверхности кора, вытянутые «плечи» соединяют соседние нуклеосомы. При этом ДНК наматывается на соседние коры ка­ждый paз в противоположном направлении (рис. 14).

Выделить нуклеосомы можно непродолжительной обработкой хромосом ферментами дезоксирибонуклеазами. При этом расщепляются участки состыковки нуклеосом. В геноме человека содержатся 1,5 х 10 7 нуклеосом.

Нуклеосомный уровень повышает плотность упаковки ДНК в 7-10 раз. (Рис. 14, 20)

Рис.14. Модель нуклеосомной фибриллы.

2. Нуклеомерный уровень . Дальнейшая компактизация ДНК в составе хроматина свя­зана с образованием нуклеосомных комплексов (рис. 15, 20).Образуется компактная хроматиновая фибрилла построенная либо по типу соленоида (спиральный тип укладки), либо по нуклеомерному типу (4-12 нуклеосом образуют глобулу).

Нуклеомерная укладка хроматина способствует укорочению нити ДНК примерно в 6 раз, а оба уровня приводят к компактизации ДНК в среднем в 50 раз (42-60).

3. Хромомерный уровень.

Следующий этап компактизации ДНК связан с образованием петлеобразных структур, которые называются хромомерами (рис.16). При этом возможны два пути упаковки ДНК с помощью негистоновых белков:

Рис. 16. Хромомерный тип укладки хромосом.

Нить нуклеосом разбита на участки по 20 - 80 тысяч пар азотистых оснований (в среднем – 50 тысяч). В местах разбивки находятся молекулы – глобулы - негистоновых хромосомных белков. ДНК - связывающие белки узнают глобулы негистоновых белков и сближают их. Образуется устье петли. Средняя длина петли (300-400 нм) сходна у различных организмов (дрозофила и человек) и включает примерно 50 тысяч оснований. Такую петельную структуру называют интерфазной хромонемой.

Хроматин типа «ламповых щеток» - это интерфазный эухроматин (рис.17.). Считают, что петли имеют связи с белками хромосомного каркаса, ядерного матрикса и белками ламины.

Рис. 17. Фрагменты хромосом типа «ламповых щеток» из ядра ооцита тритона.

Можно видеть участки ДНК, образующие петли от центральной оси. (С. Гильберт, 1993, т. 2, с. 186)

Укорочение фибриллы на этом уровне происходит в среднем 25 раз, а на всех 3 уровнях в 1000-1500 раз.

4. Хромонемный уровень . При делении клеток идет дальнейшая компактизация хро­мосом - образование более крупных петель из хромомерной фибриллы. На поверхности упакованные молекулы ДНК несут множество белков, которые образуют подобие чехла. Ес­ли удалить этот чехол, то под электронным микроскопом можно отчетливо увидеть, что каждая хроматида построена из хроматиновых петель, отходящих от центральной оси. Диа­метр такой упаковки 700 нм (рис. 18).

Рис.18. Хромонемный тип укладки хромосом.

5. Хромосомный уровень . Даль­нейшая компактизация хромосом обеспечивается петельной укладкой хромонемной нити (рис.19.), что сокращает их длину примерно в 10 раз.

Рис.19. Хромосомный тип укладки.

На этом этапе происходит объединение петель имеющих одинаковую организацию, образуются блоки или минидиски. В образовании одного минидиска участвуют примерно около 20 петель. Таким образом, за счет нескольких уровней компактизации длина ДНК сокращается примерно в 10000 раз. Конденсация хромосом из деконденсированного состояния - это не спирализация , а очень сложный комплекс компактизации , связанный не только с изменением их линей­ных размеров , но и с регуляцией их работы в процессе жизне­деятельности клетки. (Рис. 20)

Кроме того, компактизация хромосомы - важнейший процесс, связанный с точной передачей наследственной ин­формации очередному поколению.

1) Нуклеосомный – на этом уровне двойная спираль ДНК наматывается на белковый комплекс, содержащий 8 молекул гистонов – белков с повышенным содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков лизина и аргинина. Это гистоны Н2В, Н2А, Н4 и Н3. Образуется структура диаметром 11 нм, напоминающая бусы на нитке. Каждая «бусина» – нуклеосома содержит около 150 пар нуклеотидов. Нуклеосомный уровень даёт укорочение молекулы ДНК в 7 раз. При репликации этот уровень упаковки снимается, а при транскрипции нуклеосомы сохраняются.

2) На втором уровне нуклеосомы сближаются с помощью гистона Н1, в результате чего образуется фибрилла диаметром 30 нм. Сокращение линейного размера ДНК происходит в 6-10 раз. Этот уровень упаковки, как и первый, не зависит от первичной структуры ДНК.

3) Петлевой уровень. Обеспечивается негистоновыми белками. Они узнают определённые последовательности ДНК и связываются с ними и друг с другом, образуя петли по 20-80 тыс. п.н. Укорочение за счет петель проходит в 20-30 раз. Типичная хромосома млекопитающих может содержать до 250 петель.

4) Метафазная хромосома. Перед делением клетки молекулы ДНК удваиваются, петли укладываются в стопки, хромосома утолщается и видна в световой микроскоп. На этом уровне упаковки каждая хромосома состоит из двух хроматид. Каждая из хроматид содержит по одной молекуле ДНК.

Функции ДНК.

1. ДНК является носителем генетической информации . Функция обеспечивается фактом существования генетического кода.

2. Воспроизведение и передача генетической информации в поколениях клеток и организмов . Функция обеспечивается процессом репликации .

3. Реализация генетической информации в виде белков, а также любых других соединений, образующихся с помощью белков-ферментов. Функция обеспечивается процессами транскрипции и трансляции .

Непосредственно из структуры ДНК вытекает механизм её точного воспроизведения (репликации). В основе репликации структуры ДНК лежит принцип комплементарности : в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны друг с другом за счёт образования пар Г – Ц, Ц – Г, А – Т, Т – А. Если две цепи двойной спирали расходятся, то на каждой из них может строиться новая комплементарная цепь – напротив Г исходной цепи установится Ц новой цепи, напротив Ц старой цепи – Г новой цепи, напротив А – Т, а напротив Т – А. В результате получатся две дочерние двойные спирали, полностью идентичные исходной – материнской.

Рибонуклеиновые кислоты повсеместно распространены в живой природе. Биологическая функция РНК обусловлена тем, что они обеспечивают реализацию в клетке наследственной информации, которая передаётся с помощью ДНК.

В клетке существует три главных типа РНК: информационная РНК (иРНК), рибосомная РНК (рРНК) и транспортная РНК (тРНК).

РНК – полинуклеотид, похожий на ДНК, но имеющий свои особенности.

1) Углевод в РНК представлен рибозой, имеющей во втором положении углеродного атома гидроксильную группу.

2) В отличие от ДНК молекулы всех трех типов РНК одноцепочечные, что является одной из важных особенностей РНК. Кроме того, отличительной особенностью РНК является то, что для неё не характерно устойчивое спиральное строение.

3) В РНК содержатся 4 азотистых основания – аденин, цитозин, гуанин и урацил.

Выделяют следующие общие принципы строения всех видов РНК:

1) РНК – одноцепочечный полинуклеотид.

2) РНК формирует вторичную структуру – набор коротких спиральных участков, которые образуются за счёт антипараллельного комплементарного спаривания смежных отрезков цепи.

3) РНК способна образовывать третичную структуру за счёт дальних комплементарных взаимодействий внутри цепи и межспиральных взаимодействий.

4) Высокополимерная РНК способна сворачиваться в компактные частицы.

5) РНК обладает значительной конформационной подвижностью.