Хроматин находится в. Различия на уровне структуры

Генетический материал эукариотических организмов имеет очень сложную организацию. Молекулы ДНК, находящиеся в клеточном ядре, входят в состав особого многокомпонентного вещества - хроматина.

Определение понятия

Хроматином называется содержащий наследственную информацию материал клеточного ядра, представляющий собой сложный функциональный комплекс ДНК со структурными белками и другими элементами, обеспечивающими упаковку, хранение и реализацию кариотического генома. В упрощенной трактовке это вещество, из которого состоят хромосомы. Термин происходит от греческого "хрома" - цвет, краска.

Понятие было введено Флемингом еще в 1880 году, но до сих пор идут споры о том, что такое хроматин, с точки зрения биохимического состава. Неопределенность касается небольшой части компонентов, не участвующих в структурировании генетических молекул (некоторые ферменты и рибонуклеиновые кислоты).

На электронной фотографии интерфазного ядра хроматин визуализируется как многочисленные участки темной материи, которые могут быть мелкими и разрозненными или объединяться в крупные плотные скопления.

Конденсация хроматина во время клеточного деления приводит к образованию хромосом, которые видны даже в обычном световом микроскопе.

Структурные и функциональные компоненты хроматина

С целью определить, что такое хроматин на биохимическом уровне, ученые экстрагировали это вещество из клеток, переводили в раствор и в таком виде изучали компонентный состав и структуру. При этом использовались как химические, так и физические методы, включая технологии электронной микроскопии. Выяснилось, что химический состав хроматина на 40% представлен длинными молекулами ДНК и почти на 60% - различными белками. Последние подразделяются на две группы: гистоны и негистоновые.

Гистонами называют большое семейство основных ядерных белков, которые прочно связываются с ДНК, формируя структурный скелет хроматина. Их количество примерно равно процентному содержанию генетических молекул.

Остальная часть (до 20%) протеиновой фракции приходится на ДНК-связывающие и пространственно-модифицирующие белки, а также ферменты, принимающие участие в процессах считывания и копирования генетической информации.

Помимо основных элементов, в составе хроматина в небольшом количестве обнаруживаются рибонуклеиновые кислоты (РНК), гликопротеиды, углеводы и липиды, однако вопрос об их ассоциации с ДНК-упаковочным комплексом до сих пор открыт.

Гистоны и нуклеосомы

Молекулярная масса гистонов варьирует в пределах от 11 до 21 кДа. Большое количество остатков основных аминокислот лизина и аргинина придают этим белкам положительный заряд, способствуя формированию ионных связей с противоположно заряженными фосфатными группами двойной спирали ДНК.

Выделяют 5 разновидностей гистонов: H2A, H2B, H3, H4 и H1. Первые четыре типа участвуют в формировании основной структурной единицы хроматина - нуклеосомы, которая состоит из кора (белковой сердцевины) и обмотанной вокруг него ДНК.

Нуклеосомный кор представлен октамерным комплексом из восьми молекул гистонов, в который входят тетрамер H3-H4 и димер Н2A-H2B. Участок ДНК протяженностью около 146 нуклеотидных пар накручивается на поверхность белковой частицы, образуя 1,75 витка, и переходит в линкерную последовательность (примерно 60 н. п.), соединяющую нуклеосомы друг с другом. Молекула H1 связывается с линкерной ДНК, защищая ее от действия нуклеаз.

Гистоны могут подвергаться различным модификациям, таким как ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, ADP-рибозилирование и взаимодействие с убивиктиновым белком. Эти процессы влияют на пространственную конфигурацию и плотность упаковки ДНК.

Негистоновые белки

Существует несколько сотен разновидностей негистоновых белков с различными свойствами и функциями. Их молекулярная масса варьирует от 5 до 200 кДа. Особую группу составляют сайт-специфические белки, каждый из которых комплементарен определенному участку ДНК. В эту группу входят 2 семейства:

Лучше всего изучены так называемые белки высокой подвижности (HGM-белки), постоянно ассоциированые с хроматином. Такое наименование семейство получило из-за высокой скорости перемещения белковых молекул в электрофорезном геле. Эта группа занимает большую часть негистоновой фракции и включает в себя четыре основных типа HGM-белков: HGM-1, HGM-14, HGM-17 и HMO-2. Они выполняют структурную и регуляторную функции.

К негистоновым белкам относят также ферменты, обеспечивающие транскрипцию (процесс синтеза матричной РНК), репликацию (удвоение ДНК) и репарацию (устранение повреждений в генетической молекуле).

Уровни компактизации ДНК

Особенность структуры хроматина такая, что позволяет нитям ДНК с суммарной длиной более метра поместиться в ядро диаметром около 10 мкм. Такое возможно благодаря многоступенчатой системе упаковки генетических молекул. Общая схема компактизации включает пять уровней:

нуклеосомная нить диаметром 10-11 нм;
фибрилла 25-30 нм;
петлевые домены (300 нм);
волокно толщиной 700 нм;
хромосомы (1200 нм).

Такая форма организации обеспечивает уменьшение длины исходной молекулы ДНК в 10 тысяч раз.

Нить диаметром 11 нм образована рядом нуклеосом, связанных линкерными участками ДНК. На электронной микрофотографии такая структура напоминает нанизанные на леску бусы. Нуклеосомная нить сворачивается в спираль по типу соленоида, образуя фибриллу толщиной 30 нм. В ее формировании участвует гистон H1.

Соленоидная фибрилла складывается в петли (иначе - домены), которые закрепляются на поддерживающем внутриядерном матриксе. Каждый домен содержит от 30 до 100 тысяч пар нуклеотидов. Такой уровень компактизации характерен для интерфазного хроматина.

Структура толщиной 700 нм образуется при спирализации доменной фибриллы и называется хроматидой. В свою очередь, две хроматиды формируют пятый уровень организации ДНК - хромосому диаметром 1400 нм, которая становится видна на стадии митоза или мейоза.

Таким образом, хроматин и хромосома - это формы упаковки генетического материала, зависящие от жизненного цикла клетки.

Хромосомы

Хромосома состоит из двух идентичных друг другу сестринских хроматид, каждая из которых образована одной суперспирализованной молекулой ДНК. Половинки соединяются особым фибриллярным тельцем, называемым центромерой. Одновременно эта структура является перетяжкой, разделяющей каждую хроматиду на плечи.

В отличие хроматина, представляющего собой структурный материал, хромосома - это дискретная функциональная единица, характеризующаяся не только структурой и составом, но и уникальным генетическим набором, а также определенной ролью в реализации механизмов наследственности и изменчивости на клеточном уровне.

Эухроматин и гетерохроматин

Хроматин в ядре существует в двух формах: менее спирализованной (эухроматин) и более компактной (гетерохроматин). Первая форма соответствует транскрипционно-активным участкам ДНК и поэтому структурирована не так плотно. Гетерохроматин подразделяется на факультативный (может переходить из активной формы в плотную неактивную в зависимости от стадии жизненного цикла клетки и необходимости реализовать те или иные гены) и конститутивный (постоянно уплотнен). Во время митотического или мейотического деления весь хроматин неактивен.

Конститутивный гетерохроматин обнаружен возле центромер и в концевых участках хромосомы. Результаты электронной микроскопии показывают, что такой хроматин сохраняет высокую степень конденсации не только на стадии деления клетки, но и во время интерфазы.

Биологическая роль хроматина

Основная функция хроматина заключается в плотной упаковке большого количества генетического материала. Однако просто уместить ДНК в ядре для жизнедеятельности клетки недостаточно. Необходимо, чтобы эти молекулы должным образом "работали", то есть, могли передавать заключенную в них информацию по системе ДНК-РНК-белок. Кроме этого, клетке нужно распределять генетический материал во время деления.

Устройство хроматина полностью отвечает этим задачам. Белковая часть содержит все необходимые ферменты, а особенности структуры позволяют им взаимодействовать с определенными участками ДНК. Поэтому, второй важной функцией хроматина является обеспечение всех процессов, связанных с реализацией ядерного генома.

В ядре ДНК всегда находится в комплексе с белками и упакована в той или иной степени в нуклеопротеиновые структуры.

В хромосомах ДНК (около 40% от всего хроматина) находится в комплексе с основными и кислыми белками, что обеспечивает многоступенчатую компактизацию молекулы ДНК. Первые уровни компактизации осуществляются при взаимодействии ДНК с основными белками - гистонами. Гистоны имеют повышенное содержание основных аминокислот - лизина и аргинина. Пять типов гистонов отличаются друг от друга относительным содержанием этих двух аминокислот. Гистоны Н3 и Н4 очень консервативны. Секвенирование гена гистона Н4 показало, что у теленка и гороха этот белок отличается всего двумя аминокислотами. Наиболее изменчивы гистоны Н2А и Н2В. Комплекс между ДНК и гистонами формирует нуклеосомную структуру хроматина. Пары молекул гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 формируют гистоновый октамер клиновидной формы (рис. 1). Узкая часть образована тетрамером Н3-Н4, а широкая состоит из Н2А-Н2В. N-концевые части гистонов свободно расходятся в стороны. Участок ДНК в 146 пн связывается с октамером, делая 1,75 оборота вокруг него. Комплекс данного участка ДНК с гистоновым октамером называют нуклеосомой . Участок ДНК между соседними нуклеосомами называют линкерным (около 60 пн). Более 90% ДНК в клетке присутствует в виде нуклеосом, при этом длина нити ДНК уменьшается в 7 раз, а толщина сформированной нуклеопротеиновой нити составляет 10 нм.

Гистоны контактируют с фосфодиэфирным остовом молекулы ДНК. Существуют и гидрофобные взаимодействия с остатками рибозы. Азотистые основания во взаимодействии с гистонами не участвуют. Поэтому связывание ДНК с нуклеосомной глобулой не является специфичным в отношении нуклеотидной последовательности.

Рисунок 1. Строение нуклеосом

Гистон Н1 взаимодействует с обоими концами ДНК, входящей в состав нуклеосомы, в районе тетрамера Н3-Н4, т.е. Н1 как бы обозначает границы линкерной ДНК. В молекуле гистона Н1 можно выделить глобулярную сердцевину, N-конец и С-конец. Взаимодействие между N- и С-концами соседних молекул гистона Н1 обеспечивает сближение нуклеосом. При этом нуклеосомная нить сворачивается в спираль или образует зигзагообразную нить толщиной 30 нм, состоящую из сближенных нуклеосом - нуклеомеров. Каждая нуклеомера состоит из 8-10 нуклеосом.

Рисунок 2. Взаимодействие гистонов в составе нуклеосом

Исследования последних лет подтверждают зигзагообразную модель организации 30 нм фибриллы. В стабилизации этой фибриллы большую роль играют взаимодействия N-концевых доменов гистонов соседних нуклеосом. Архитектура фибриллы может существенно меняться при модификации N-концевых доменов гистонов, что может стимулировать либо дальнейшую конденсацию, либо деконденсацию фибриллы. Есть данные о том, что ацетилирование гистонов способствует разворачиванию компактной 30 нм хроматиновой фибриллы до нуклеосомной нити.

Рисунок 3. Уровни компактизации хроматина

У ксенопуса выделены белки, контролирующие взаимодействие ДНК с гистоновыми белками. Например, белок нуклеоплазмин - состоит из 5 идентичных субъединиц, контролирует образование нуклеосом. Этот белок кислый, он не связывается со свободной ДНК, связывается только с гистонами.

Экспрессия генов основных гистонов происходит только в S -фазу чтобы обеспечить упаковку вновь синтезированной ДНК. Но ограничение синтеза гистонов может грозить нарушением целостности хромосом, например, при репарации поврежденной ДНК. Поэтому многие организмы имеют альтернативные копии гистоновых генов, которые кодируют варианты гистонов и экспрессируются конститутивно на низком уровне в течение всего клеточного цикла.

Описаны вариантные формы гистонов (табл. 2), которые кодируются отдельными генами. Включение в нуклеосомную частицу вариантных форм гистонов может существенно изменять структуру гистонового октамера. Существует четкая корреляция между присутствием в нуклеосомах вариантных форм гистонов и осуществлением тех или иных функциональных процессов. Например, ряд вариантных форм гистона Н3 (CENP-A) участвует в формировании центромер. Некоторые варианты обмениваются с уже существующими гистонами в ходе развития и дифференцировки - их называют замещающими гистонами. Такое замещение часто приводит к тому, что варианты становятся доминируюшщими в дифференцированной клетке. Предположение - варианты гистонов выполняют спец. функции в клетках.

Имеется много вариантов гистона Н1, например, Н10, Н5, варианты, специфичные для сперматозоидов (SpH1) и яичек (H1t). Наибольшее число вариантов описано для гистона Н2А. Варианты гистона Н2А отличаются по размеру и последовательности хвоста, а также по характеру распределения в геноме. Например, H2A-Bbd локализуется в активной Х-хромосоме и аутосомах, а Macro Н2А находится в основном в Xi. У гистона Н3 есть два основных варианта - Н3ю3 и центромерный Н3 (СеnH3), а также тканеспецифичный вариант Н3.4 (яички млекопитающих). Гистон СеnH3 способствует образованию белковой структуры кинетохоров. Гистон Н3.3 служит меткой активного хроматина, азмещение Н3 на Н3.3 это динамичный механизм быстрой активации хроматина. Вариантов гистона Н4 пока не известно.

Таблица 2

Основные варианты гистонов и их действие на хроматин

	Основной гистон	Действие на хроматин
		Конденсация хроматина
		Конденсация хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая структура хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая структура хроматина

		Конденсация хроматина
		Открытая/закрытая структура хроматина
		Конденсация хроматина

		Открытая структура хроматина

Дальнейшая упаковка хроматина достигается за счет взаимодействия ДНК с негистоновыми белками. Они разнообразны - более 500, составляют до 2/3 всех белков хроматина. Многие из этих белков участвуют в репликации, репарации ДНК, транскрипции. Часть из них выполняет структурную функцию - образуют ядерную мембрану, поровые комплексы. Часть белков формирует белковый каркас хромосом. На белках ядерной мембраны в интерфазу закреплены расположенные розетками петли 30-нм фибриллы. Это третий уровень компактизации хроматина - хромомерный. Средний размер розеток достигает 120-150 нм. Каждый хромомер состоит из нескольких, содержащих нуклеомеры петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина. Размер отдельной петли совпадает с размером среднего репликона и может соответствовать одному или нескольким генам (50-100 тпн). На хромосому в среднем приходится более 2000 таких петельных доменов ДНК. Петельно-доменная структура хроматина организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены. Наряду с участками начала репликации в области прикрепления ДНК к ядерному матриксу часто локализуются и другие регуляторные элементы - энхансеры, сайленсеры, промоторы и т.д. Помещение того или иного промотора, гена или генного домена на ядерный матрикс способствует его активации. Далее - хромонемный уровень компактизации - нитчатая структура толщиной 0,1-0,2 мкм. Полагают, что отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образует вокруг осевого элемента хромосомы один виток.

Компактизация метафазных хромосом оценивается как 10000-кратная. К стадии зиготены мейоза наружная поверхность хроматиновой нити содержит всего около 1% ДНК. Механизм не известен. Доказано, что укладка ДНК в митотическую хромосому осуществляется комплексом белков, называемым 13S-конденсином . Комплекс обладает АТФ-азной активностью, способен связываться с ДНК и, вероятно, наматывает ее на себя. 13S-конденсин лягушки состоит из двух структурных субъединиц - ассоциированных с хромосомами белков ХСАР-С и ХСАР-Е и трех регуляторных субъединиц. Вне комплекса ни одна из субъединиц не индуцирует конденсацию хромосом. Мутации в генах, кодирующих белки конденсинового комплекса, нарушают конденсацию и сегрегацию хромосом, блокируют клетки в митозе. В процессе упаковки хромосом конденсин локализуется в районах, где гистон Н3 фосфорилирован. По мере фосфорилирования гистона Н3 ДНК становится более доступной для связывания с конденсином. Конденсация хромосом и фосфорилирование гистона Н3 начинается с центромерных областей и распространяется к теломерным.

К стадии зиготены мейоза на наружней поверхности хроматиновой нити остается всего около 1% ДНК.

Степень деконденсации хроматина в интерфазном ядре отражает его функциональную нагрузку. Чем более диффузен хроматин, тем он активнее. В составе хромосом выделяют участки гетерохроматина и эухроматина . Эухроматин в интерфазе находится в деспирализованном состоянии, в нем находятся структурные активные гены. В эухроматиновых участках, помимо элементарных дезоксирибонуклеопротеидных нитей, имеются рибонуклеопротеидные частицы диаметром 200-500 анстрем, называемые РНП-гранулами. Эти частицы представляют собой форму упаковки молекул РНК, синтезированных на ДНК и соединённых с белком, и служат для завершения образования информационной РНК и переноса её в цитоплазму

Термин «гетерохроматин» был предложен Хейцом в 1928 году. Гетерохроматин расположен в районе центромеры, теломер и внутри плеч хромосом - интеркалярный гетерохроматин . Гетерохроматиновые участки значительно дольше представлены в клеточном цикле в виде плотно спирализованных фрагментов. Они деспирализуются значительно позже, чем эухроматин или совсем не деспирализуются, сохраняясь в интерфазном ядре в виде плотно окрашенных глыбок - хромоцентров . Гетерохроматиновые районы хромосом могут ассоциироваться друг с другом - эктопическая конъюгация. В результате здесь возможна повышенная частота хромосомных перестроек. Еще одной особенностью гетерохроматина является варьирование его количества в геноме.

Гетерохроматиновые участки ДНК содержат долгоживущие разрывы, тогда как в эухроматине разрывы возникают редко и быстро репарируются. Ядра лимфоцитов периферической крови почти полностью состоят из гетерохроматина и неактивны в транскрипции. В них обнаружено около 3000 разрывов на диплоидный геном мыши. Установлено, что после активации лимфоцитов разрывы репарируются. Очень плотно упакованная ДНК сперматозоидов содержит 107 разрывов на геном. Таким образом, наличие разрывов ДНК позволяет плотную упаковку, но несовместимо с транскрипцией.

Стабильно выявляемые гетерохроматиновые районы называют конститутивным гетерохроматином. Эти районы, как правило, генетически не активны. Пример - сателлитная ДНК прицентромерного гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматин располагается в одних и тех же положениях на обеих хромосомах из пары гомологов. Гены в гетерохроматине все-таки есть, но их гораздо меньше, чем в эухроматине. Пример - гены рРНК.

Факультативный гетерохроматин формируется при конденсации хроматина на определенных стадиях жизненного цикла и обычно присутствует лишь в одной хромосоме из пары гомологов. Яркий пример - мучнистый червец. У самок этого вида нет факультативного гетерохроматина. У самцов весь отцовский гаплоидный набор хромосом целиком становится гетерохроматиновым. В итоге самец имеет эухроматиновые хромосомы, полученные от матери, и гетерохроматиновые, полученные от отца. В ходе мейоза у самцов гетерохроматиновые хромосомы деспирализуются, в спермии попадает уже эухроматиновый материал. Если потомок окажется самцом, то эти хромосомы конденсируются. Таким образом, у самцов экспрессируются только материнские гены.

У млекопитающих факультативный хроматин проявляется при инактивации Х-хромосомы. В 1949 г Барр и Бертрам обнаружили в ядрах нейронов кошки интенсивно окрашенные тельца, названные тельцами Барра . Они представляют собой неактивную Х-хромосому. Различают три возможных расположения полового хроматина в ядре: тесное соприкосновение его с ядрышком; свободное расположение в кариоплазме и контакт с ядерной ембраной.

Таким образом, у самок млекопитающих транскрипционно активна только одна Х-хромосома - это феномен компенсации дозы гена . Факультативный гетерохроматин обогащен повторами типа LINE, которые способствуют конденсации хроматина.

В ходе раннего развития самок млекопитающих обе Х-хромосомы активны. На предимплантационных стадиях развития эмбриона происходит инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца. Во время имплантации зародыша происходит реактивация и последующая инактивация случайно либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Иногда наблюдается предпочтительная инактивация отцовской Х-хромосомы (у сумчатых). Процесс инактивации контролируется сложным локусом Х-хромосомы - центром инактивации Xiс. Данный локус содержит ген Xist (Х inactive specific transcript). Продуктом этого гена является некодирующая ядерная РНК размером 16 тн.

Ген Xist имеет 3 промотора - Р0, Р1 и Р2. Если транскрипция идет с прототоров Р1 или Р2 - образуется стабильный продукт размером 15 т.п.н., если с промотора Р0 - возникает нестабильный продукт. Переключение транскрипции с Ро на Р1/Р2 коррелирует с началом инактивации Х-хромосомы. В функционально активной Х-хромосоме ген Xist инактивирован за счет метилирования ЦГ-динуклеотидов в промоторе гена.

РНК гена Xist не способна переходить с одной Х-хромосомы на другую. РНК Xist присоединяет различные белки, образуя комплексы, которые распределяются вдоль всей Х-хромосомы, запуская ее инактивацию. Они, несомненно, принимают участие в установлении неактивного состояния, так как Х-хромосома, у которой отсутствует район гена Xist, никогда не инактивируется. Если же ген Xist искусственно перенести на аутосому, то она инактивируется.

В период инициации инактивации продукт гена Xist становится стабильным и распространяется вдоль по всей длине Х-хромосомы. Это подавляет транскрипцию генов и приводит к модификации гистонов. После отделения линии герминальных клеток в соматических клетках происходит гиперметилирование инактивируемой хромосомы; неактивное состояние становится необратимым и наследуется в ряду клеточных поколений. В линии герминальных клеток самок ДНК инактивированной Х-хромосомы остается неметилированной и впоследствии хромосома реактивируется незадолго до вхождения клеток в мейоз. В зрелых ооцитах обе Х-хромосомы активны.

Выбор того, какая Х-хромосома инактивируется, случаен, но это может регулироваться аллелями Xce (X-linced X controlling element). На линиях мышей было обнаружено три аллеля Хсе - «слабый» Xcea, «промежуточный» Xceb и «сильный» Xcec. В гетерозиготах наиболее часто инактивируются те Х-хромосомы, которые несут более слабый аллель. У гомозигот выбор происходит случайно. Xce локус расположен вблизи Xic. Предполагается, что Xce связывают транс-факторы, регулирующие работу генов в Xic, предопределяя выбор между Х-хромосомами.

Ряд генов неактивной Х-хромосомы ускользает от инактивации. Например, избегает инактивации район спаривания с Y-хромосомой. В данном локусе находятся гены, присутствующие и на Х- и на Y-хромосомах: то есть и у XY-самцов таких генов по паре, и у XX-самок их столько же -- этим генам не нужна компенсация дозы.

Образование факультативного гетерохроматина - механизм регуляции активности генов. Пример - мозаичное проявление признаков, контролируемых сцепленными с полом генами у самок млекопитающих - кошки с черепаховой окраской (пятна черной и желтой шерсти); женщины, гетерозиготные по сцепленной с полом мутации эктодермальной дисплазии (на некоторых участках челюсти нет зубов; на теле чередуются участки кожи с наличием и отсутствием потовых желез).

Эпигенетика занимается изучением механизмов наследственности, которые модифицируют работу генов без изменения их структуры. Причем эти модификации сохраняются при митотическом делении клеток. Наиболее часто эпигенетические механизмы обеспечивают долговременную репрессию значительной части генома в специализированных клетках многоклеточного организма. Эпигенетические механизмы обеспечивают и импринтинг - инактивацию ряда генов в одной из родительских хромосом. Наиболее изученным механизмом является метилирование ДНК . В последние годы показана роль модификации гистонов , их ацетилирования (лизина) и метилирования (лизина и аргинина), а также включения в нуклеосомы неканонических форм гистонов. Модифицируются в основном свободные N-концы гистонов. Добавление ацетильных групп нейтрализует положительный заряд молекулы гистона, это изменяет конформацию нуклеосомы и изменяет доступность ДНК для различных белков. Другой вариант - с модифицированными остатками аминокислот гистонов могут специфически связываться определенные белки, запуская цепочку реакций. Метилирование лизина и аргинина участвует в образовании гетерохроматина, репарации и регуляции транскрипции. Причем разное число метильных групп у одного остатка выполняет разные биологические функции. Метилирование осуществляется ферментами гистон-метилтрансферазами , а удаление метильных групп обеспечивают гистон-деметилазы . В отличие от метилирования ацетильная группа на остатке лизина может быть только одна. Ее присоединение осуществляют гистон-ацетилтрансферазы , а удаление - гистон-деацетилазы. Эухроматиновые домены характеризуются гиперацетилированной формой гистонов; в гетерохроматине гистоны гипоацетилированы.

Ацетилирование гистонов ослабляет межнуклеосомное взаимодействие, а также взаимодействие хвостов нуклеосомы с линкерной ДНК. Доступность ДНК при этом увеличивается, то есть ацетилирование гистонов связано с активацией транскрипции.

Активный промотор гена должен быть свободен от нуклеосом. Важную роль в этом играет ацетилирование гистонов, в том числе гистона H2A.Z в промоторной области. Гистон H2A.Z присутствует как в активных, так и в неактивных промоторах и именно его ацетилирование существенно для активации промотора.

Метилирование гистонов не изменяет суммарный заряд нуклеосомы. Но ковалентно модифицированные гистоны служат «метками» для связывания белковых факторов, которые стимулируют определенные события. Наиболее распространенный вариант метилирования гистонов - это метилирование лизина.

Образование прицентромерного гетерохроматина является результатом модификации гистонов и прежде всего метилированием лизина в молекуле гистонов Н3 и Н4. Метилированные остаток лизина узнают различные белки, которые запускают процессы, связанные с «молчанием». Например, у инфузории с метилированным лизином связываются белки Pddq, Pdd3 , что вызывает диминуцию хроматина. У млекопитающих и дрозофилы модифицированный гистон Н3 может взаимодействовать с белком НР1 (Heterochromatin protein 1 ), который в свою очередь может привлекать множество других белков. Полагают, что связь НР1 с модифицированным гистоном Н3 необходима для стабилизации репрессированного состояния гетерохроматина.

Инактивация Х-хромосомы млекопитающих сопровождается гипоацетилированием гистонов Н2А, Н3 и Н4 и метилированием гистона Н3.

Другим вариантом модификации гистонов является их фосфорилирование - дефосфорилирование, что обеспечивает декомпактизацию хроматина при активации транскрипции и конденсацию хромосом во время деления клетки или апоптоза. Баланс фосфатных групп поддерживают киназы и фосфотазы.

Образец модификаций молекул гистонов называют «гистоновым кодом» . Гипотеза «гистонового кода» предполагает, что эти модификации являются предпосылкой для последующего изменения структуры хроматина и стабильно поддерживают характер экспрессии генов в ходе клеточных делений. Посттрансляционные модификации гистонов (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и др.) создают специфические сайты связывания для регуляторных белков хроматина.

Формирование гетерохроматина строго детерминировано и происходит на определенной стадии эмбрионального развития, когда начинается транскрипция на хромосомах развивающегося эмбриона. Формирование гетерохроматиновых доменов надежно защищает организм от экспрессии генетического материала, которая не нужна в соматических клетках.

Помимо образования гетерохроматина другим механизмом «выключения» некодирующих последовательностей является диминуция хроматина. Это программируемая элиминация части генетического материала из генома презумптивных соматических клеток.

У циклопов в 3-7 делениях дробления элиминируется от 10 до 94% генома germ line. Цитологическая картина диминуции хроматина видоспецифична. Доля элиминируемой ДНК не зависит от исходного размера генома. Например, 2 вида циклопов Cyclops kolensis, Cyclops insignis обитают в одинаковых условиях, количество ДНК в диплоидных клетках примерно одинаково - 4,6 пг и 4,3 пг. У C. kolensis после диминуции остается лишь 6% генома. Однако при этом количество хромосом не изменяется (22), хотя размеры их становятся существенно меньше. У C. insignis диминуции хроматина не происходит.

У циклопов перед диминуцией хроматина происходит удлинение интерфазы в 8-9 раз. В конце этой интерфазы появляются плотные гранулы хроматина (до 600). Далее они сливаются, вокруг них формируется плотная однослойная без пор мембрана, непрницаемая для факторов декомпактизации. Внутри этих гранул происходит лизис ДНК.

Генетический аппарат ресничных инфузорий отличается ядерным диморфизмом. Он проявляется в наличии в клетке двух типов ядер: микронуклеуса (Ми) и макронуклеуса (Ма). Ми служит генеративным ядром, используемым для передачи наследственной информации в ряду поколений. В вегетативно растущих клетках гены Ми не транскрибируются. Зато активно транскрибируются гены Ма, выполняющего роль рабочего ядра и контролирующего процессы жизнедеятельности.

При конъюгации у инфузорий две клетки прикладываются друг к другу и плавают вместе 10-12 часов, а затем расходятся. За время конъюгации их Ма начали разрушаться, а Ми поделились путем мейоза на четыре гаплоидных ядра каждое. Ход последующих событий варьирует в деталях у разных видов инфузорий, но принципиальная схема общая: клетки партнеров обмениваются гаплоидными ядрами, по одному от каждой клетки, затем каждое сливается с местным (стационарным) гаплоидным ядром, то есть происходит оплодотворение. К этому моменту все лишние ядра дегенерируют, и в каждой клетке остается по одному диплоидному ядру - продукту оплодотворения. После расхождения партнеров ядро делится митотически на два. Одно из дочерних ядер останется Ми, другое превратится в Ма. Развитие Ма занимает несколько дней и сопровождается полной реорганизацией генома Ми-предшественника.

ДНК хромосом Ми имеет большие размеры, характерные для эукариотических хромосом. Гены в них собраны в группы с длинными промежутками между ними, заполненными разнообразными уникальными и повторяющимися последовательностями ДНК. Важная особенность генов Ми заключается в том, что все они прерваны особыми элементами, называемым IES (internal eliminated sequences). Кодирующие участки генов, разделенные IES, называют MDS (macronuclear destined sequences). Каждая IES уникальна. Размеры изученных IES варьируют от 14 до 548 п.н.

Вся ДНК в Ма представлена короткими молекулами с размерами от нескольких сот п.н. до 15 т.п.н., не содержащими никаких IES. Каждая молекула содержит одну единицу транскрипции и соответствует одному гену. Она окаймлена теломерами в виде повторов нуклеотидов, например повторов 5"-С4А4 у Oxytricha, то есть каждый ген в Ма является отдельной хромосомой. Каждый ген-хромосома представлен множеством (до тысячи, у некоторых генов до десятков тысяч) копий.

Рисунок 4. Дифференцировка Ма у брюхоресничных инфузорий: а - общая схема дифференцировки ядер из оплодотворенного ядра; б - схема превращения микроядерного гена в ген Ма

Перестройка генетического материала происходит при развитии Ма из Ми. Она начинается сразу после конъюгации с множественных раундов репликации хромосом в исходном Ми без его деления. Это приводит к образованию политенных хромосом. Политенизация хромосом увеличивает их размеры.

Во время политенизации происходит важное для реорганизации генома Ми удаление всех IES. Оно осуществляется путем множественных событий рекомбинации по прямым повторам ДНК, имеющимся на концах каждого IES. У E. crassus IES несут концевые повторы от 2 до 4 п.н. и всегда содержат димер 5"-TA, у O. nova - от 2 до 19 п.н. и не содержат 5"-TA. Поскольку IES прерывают кодирующие участки генов (MDS), состыковка последних при вырезании IES (в виде колец) происходит с точностью до нуклеотида по той же схеме, что и аналогичная рекомбинация у бактерий. Помимо коротких IES ДНК Ми E. crassus содержит два родственных элемента размером около 5,3 т.п.н., называемых TEC1 и TEC2. Эти элементы принадлежат к подвижным генетическим элементам. TEC-элементы представлены в Ми примерно 30 тыс. копиями и все вырезаются в виде колец.

После политенизации и удаления IES и подвижных элементов происходит разрезание политенных хромосом на фрагменты, соответствующие отдельным генам. Механизм фрагментации хромосом пока невыяснен. У равноресничных инфузорий, к которым принадлежит всем известная инфузория-туфелька, обнаружены особые участки, в которых происходят разрывы хромосом. Их называют CBS (chromosome breakage sequences). У брюхоресничных такие участки не обнаружены.

Фрагментация хромосом сопровождается массовым удалением и распадом всех других последовательностей ДНК, расположенных в межгенных промежутках. Окончательно исчезают остатки ядер и вырезанные раньше кольцевые ДНК.

Оставшиеся сегменты воссоединяются. При этом возможно изменение порядка расположения экзонов структурных генов. Например, в микронуклеусе неработающий ген состоит из экзонов 3 4 6 5 7 9 2 1 8. В макронуклеусе порядок экзонов меняется на 1 2 3 4 5 6 7 8 9, в результате возможна нормальная транскрипция гена.

В целом удаленная часть генома составляет 90-95%. На концах вырезанных генов (а они уже представлены многими копиями в результате политенизации) синтезируются теломеры (это делает фермент теломераза), после чего они дополнительно умножаются примерно до тысячи копий путем 4-6 раундов репликации. На этом дифференцировка Ма завершается, и инфузория возвращается к обычной жизни.

Диминуция хроматина у аскарид . Диминуция заключается в фрагментации хромосом и элиминации значительной части хроматина в предшественницах соматических клеток в ходе первых делений оплодотворенной яйцеклетки. Результатом этого процесса являются разная структура хромосом и разное содержание ДНК в соматических и генеративных клетках. Цитологическую картину диминуции хроматина можно рассмотреть на примере лошадиной аскариды Parascaris univalens , у которой в диплоидном ядре оплодотворенной яйцеклетки находятся всего две крупные гомологичные хромосомы (рис. 4). Первое деление дробления происходит путем обычного митоза, где хроматиды нормально распределяются по двум дочерним клеткам, обозначенным как Г1 и С1. При втором делении дробления (рис. 4, а) такой же нормальный митоз повторяется в клетке Г1, расположенной на брюшной стороне будущего зародыша. Он приводит к клеткам Г2 и С2. Другая судьба у клетки С1, в которой центральная часть хроматид распадается на большое число фрагментов. Разрывы, приводящие к образованию фрагментов, происходят в определенных участках, имеющих соответствующее название - CBR (cromosomal breakage regions). С помощью теломеразы на их концах синтезируются теломеры. Только эти фрагменты отходят в анафазе в два дочерних ядра, где становятся мелкими хромосомами, тогда как крупные концевые части хроматид остаются в экваториальной плоскости и тем самым впоследствии оказываются вне ядра, где в конечном счете элиминируются. В результате ядра двух дочерних клеток С1а и С1б содержат меньше хроматина по сравнению с клетками С2 и Г2. Это и есть диминуция хроматина. В ходе дальнейшего развития эмбриона диминуция повторяется еще три раза в клетках С2, С3 и С4, являющихся предшественницами соматических клеток (рис. 5, б). Из избежавших диминуции клеток линии, обозначаемой на рисунке буквой Г в ходе дальнейшей дифференцировки образуются генеративные клетки.

Для осуществления диминуции важно, что хромосомы нематод являются полицентрическими, то есть имеют диффузные центромеры. В митозах, сопровождаемых диминуцией, нити веретена прикрепляются только к неэлиминируемым фрагментам хроматид, что объясняет последующие события. Напротив, в митотических клетках зародышевого пути непрерывный кинетохор распространяется на всю длину хроматиды.

Рисунок 5. Диминуция хроматина у Parascaris univalens: а - цитологическая картина диминуции хроматина

На левой схеме изображены анафазы второго деления дробления на стадии двух клеток. Диминуция происходит в верхней клетке С1. В нижней клетке Г1 идет нормальный митоз. Справа представлена стадия четырех клеток после завершения второго деления дробления; б - схема дифференцировки клеток зародышевого пути и соматических клеток на ранних стадиях эмбрионального развития аскариды. Пресоматические клетки С1, С2, С3 и С4, подвергшиеся диминуции, изображены кружками, окруженными четырьмя точками.

У P. univalens при диминуции удаляется около 85% хроматина. Основная часть удаляемого материала состоит из сателлитной ДНК. Однако при диминуции удаляются и некоторые уникальные гены, например ген ALEP1 , который кодирует определенный рибосомный белок. Этот белок синтезируется только в генеративных клетках и отсутствует в соматических. Таким образом, элиминируемый хроматин содержит не просто ненужную ДНК, но необходим для клеток зародышевого пути. Предполагается, что элиминация гена ALEP1 вызывает структурные различия между рибосомами зародышевых и соматических клеток, которые могут обусловливать дифференциальную трансляцию специфических мРНК в двух типах клеток.

Эффект диминуции хроматина указывает на то, что большая часть избыточной ДНК не несет ни кодирующих, ни регуляторных функций. Функции избыточной ДНК как-то связаны с клетками germ line. Возможно, что некодирующая часть генома играет важную роль в изоляции видов, осуществляемой в мейозе при конъюгации хромосом.

При случайном скрещивании видов с диминуцией хроматина и без диминуции: В яйцеклетке в ее цитоплазме у видов с диминуцией хроматина есть ферменты, участвующие в диминуции хроматина. В результате диминуции хроматина могут подвергнуться структурные гены отцовского происхождения. Потеря структурных генов - гибель гибридного зародыша.

При обратном направлении скрещивания отцовские хромосомы не пройдут через цикл диминуции хроматина, так как в яйцеклетке не будет нужных ферментов. В результате отцовские структурные гены останутся в неактивной форме. Зародыш тоже погибнет.

Определение понятия

Структурные и функциональные компоненты хроматина

С целью определить, что такое хроматин на биохимическом уровне, ученые экстрагировали это вещество из клеток, переводили в раствор и в таком виде изучали компонентный состав и структуру. При этом использовались как химические, так и физические методы, включая технологии электронной микроскопии. Выяснилось, что химический состав хроматина на 40% представлен длинными молекулами ДНК и почти на 60% – различными белками. Последние подразделяются на две группы: гистоны и негистоновые.

Гистоны и нуклеосомы

Выделяют 5 разновидностей гистонов: H2A, H2B, H3, H4 и H1. Первые четыре типа участвуют в формировании основной структурной единицы хроматина – нуклеосомы, которая состоит из кора (белковой сердцевины) и обмотанной вокруг него ДНК.

Негистоновые белки

"цинковые пальцы" – узнают фрагменты длиной в 5 нуклеотидных пар;
гомодимеры – характеризуются структурой "спираль-поворот-спираль" во фрагменте, связанном с ДНК.

Уровни компактизации ДНК

нуклеосомная нить диаметром 10–11 нм;
фибрилла 25–30 нм;
петлевые домены (300 нм);
волокно толщиной 700 нм;
хромосомы (1200 нм).

Такая форма организации обеспечивает уменьшение длины исходной молекулы ДНК в 10 тысяч раз.

Соленоидная фибрилла складывается в петли (иначе – домены), которые закрепляются на поддерживающем внутриядерном матриксе. Каждый домен содержит от 30 до 100 тысяч пар нуклеотидов. Такой уровень компактизации характерен для интерфазного хроматина.

Структура толщиной 700 нм образуется при спирализации доменной фибриллы и называется хроматидой. В свою очередь, две хроматиды формируют пятый уровень организации ДНК – хромосому диаметром 1400 нм, которая становится видна на стадии митоза или мейоза.

Таким образом, хроматин и хромосома – это формы упаковки генетического материала, зависящие от жизненного цикла клетки.

Хромосомы

В отличие хроматина, представляющего собой структурный материал, хромосома – это дискретная функциональная единица, характеризующаяся не только структурой и составом, но и уникальным генетическим набором, а также определенной ролью в реализации механизмов наследственности и изменчивости на клеточном уровне.

Эухроматин и гетерохроматин

Биологическая роль хроматина

Структура и химия хроматина

Наименование параметра	Значение
Тема статьи:	Структура и химия хроматина
Рубрика (тематическая категория)	Экология

Хроматин – основной компонент клеточного ядра – достаточно легко получить из выделенных интерфазных ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой ионной силой или просто деионизованной водой. При этом участки хроматина набухают и переходят в гель. Чтобы такие препараты перевести в настоящие растворы, необходимы сильные механические воздействия: встряхивание, перемешивание, дополнительная гомогенизация. Это, конечно, приводит к частичному разрушению исходной структуры хроматина, дробит его на мелкие фрагменты, но практически не меняет его химического состава.

Фракции хроматина, полученные из разных объектов, обладают довольно однообразным набором компонентов. Было найдено, что суммарный химический состав хроматина из интерфазных ядер и митотических хромосом мало отличаются друг от друга. Главными компонентами хроматина являются ДНК и белки, среди которых основную массу составляют гистоны и негистоновые белки (см табл. 3).

Таблица 3. Химический состав хроматина. Содержание белков и РНК дано по отношению к ДНК

В среднем в хроматине около 40% приходится на ДНК и около 60 % на белки, среди которых специфические ядерные белки-гистоны, составляют от 40 до 80% от всех белков, входящих в состав выделенного хроматина. Кроме того в состав хроматиновой фракциии входят мембранные компоненты, РНК, углеводы, липиды, гликопротеиды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина еще не решен. Так, к примеру, РНК может представлять собой транскрибируемую РНК, которая еще не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут представлять собой вещества соосажденных фрагментов ядерной оболочки.

В структурном отношении хроматин представляет собой нитчатые комплексные молекулы дезоксирибонуклеопротеида (ДНП), которые состоят из ДНК, ассоциированной с гистонами (см. рис. 57). По этой причине укоренилось другое название хроматина – нуклеогистон. Именно за счёт ассоциации гистонов с ДНК образуются очень лабильные, изменчивые нуклеиново-гистоновые комплексы, где отношения ДНК: гистон равно примерно единице, ᴛ.ᴇ. они присутствуют в равных весовых количествах. Эти нитчатые фибриллы ДНП и есть элементарные хромосомные или хроматиновые нити, толщина которых исходя из степени упаковки ДНК может колебаться от 10 до 30 нм. Эти фибриллы ДНП могут в свою очередь дополнительно компактизоваться с образованием более высоких уровней структуризации ДНП, вплоть до митотической хромосомы. Роль некоторых негистоновых белков заключается именно в образовании высоких уровней компактизации хроматина.

ДНК хроматина. В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу подобно чистой выделенной ДНК в водных растворах. Об этом говорят многие экспериментальные данные. Так, при нагревании растворов хроматина наблюдается повышение оптической плотности раствора, так называемый гиперхромный эффект, связанный с разрывом межнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК, подобно тому, что происходит при нагревании (плавлении) чистой ДНК.

Вопрос о размере, длине молекул ДНК в составе хроматина имеет важное значение для понимания структуры хромосомы в целом. При стандартных методах выделения ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9 х 106, что значительно меньше молекулярной массы ДНК из кишечной палочки (2,8 х 109). Такую сравнительно малую молекулярную массу ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. В случае если же выделять ДНК в условиях, исключающих встряхивание, гомогенизацию и другие воздействия, то удается из клеток получить молекулы ДНК очень большой длины. Длина молекул ДНК из ядер и хромосом эукариотических клеток должна быть изучена с помощью метода светооптической радиоавтографии, подобно тому как это изучалось на прокариотических клетках.

Было обнаружено, что в составе хромосом длина индивидуальных линейных (в отличие от прокариотических хромосом) молекул ДНК может достигать сотен микрометров и даже нескольких сантиметров. Так, у разных объектов были получены молекулы ДНК от 0,5 мм до 2 см. Эти результаты показали, что есть близкое совпадение между расчетной длиной ДНК на хромосому и радиоавтографическим наблюдением.

После мягкого лизиса клеток эукариот можно прямо определять молекулярные массы ДНК физико-химическими методами. Было показано, что максимальная молекулярная масса молекулы ДНК дрозофилы равна 41 х 109, что соответствует длине около 2 см. У некоторых дрожжей на хромосому приходится молекула ДНК с молекулярной массой 1 х 108-109, которая имеет размеры около 0,5 мм.

Такие длинные ДНК представляют из себяодну молекулу, а не несколько более коротких, сшитых гуськом с помощью белковых связок, как считали некоторые исследователи. К этому заключению пришли после того, как оказалось, что длина молекул ДНК не изменяется после обработки препаратов протеолитическими ферментами.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду, хотя у микроорганизмов количество ДНК на клетку значительно ниже, чем у беспозвоночных, высших растений и животных. Так, у мыши на ядро приходится почти в 600 раз больше ДНК, чем у кишечной палочки. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют такие различные организмы как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

Значительны колебания количества ДНК в больших таксономических группах. Среди высших растений количество ДНК у разных видов может отличаться в сотни раз, аналогично тому, как и среди рыб, в десятки раз отличается количество ДНК у амфибий.

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что ʼʼизбыточноеʼʼ количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Таблица 4. Содержание ДНК в клетках некоторых объектов (пг, 10 -12 г)

Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренатурации или гибридизации ДНК. В случае если фрагментированные молекулы ДНК в растворах подвергнуть тепловой денатурации, а затем инкубировать их при температуре несколько более низкой, чем та͵ при которой происходит денатурация, то идет восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счёт воссоединения комплементарных цепей – ренатурация. Для ДНК вирусов и прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренатурации прямо зависит от величины генома; чем больше геном, чем больше количество ДНК на частицу или клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных цепей и специфической реассоциации большего числа разных по нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (рис. 53). Характер кривой реассоциации ДНК прокариотических клеток указывает на отсутствие повторяющихся последовательностей оснований в геноме прокариот; все участки их ДНК несут уникальные последовательности, число и разнообразие которых отражает степень сложности генетической композиции объектов и, следовательно, их общей биологической организации.

Совсем другая картина реассоциации ДНК наблюдается у эукариотических организмов. Оказалось, что в состав их ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. При этом для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.

В той части ДНК эукариотов, которая отличается высокой скоростью ренатурации, различают две подфракции: 1) фракцию с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК бывают повторены 106 раз; 2) фракцию умеренно повторяющихся последовательностей, встречающихся в геноме 102-103 раз. Так, у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% от общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% от всей ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных неповторяющихся генов.

Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и в связи с этим бывают выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК. У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. К примеру, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.

Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе базовых типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, ᴛ.ᴇ. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.

Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним бывают отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. ниже), участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3Н-уридином РНК. Далее цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).

За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК, особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 103 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора, структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).

ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят 3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.

Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объёме интерфазного ядра.

Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, к примеру между репликонами (см. ниже).

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые бывают повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также бывают многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.

Вместе с тем, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 106 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они бывают связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, к примеру, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.

Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.

Репликация эукариотических ДНК. Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном. От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.

У эукариотических клеток организация репликации иного характера – полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).В случае если клетки были импульсно мечены 3НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и в связи с этим остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации – репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, ᴛ.ᴇ. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей – 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК неĸᴏᴛᴏᴩᴏᴇ время в среде без 3НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.

Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.

Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счёт независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около получаса. В случае если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понужнобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.

В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток данный процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани – 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.

Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5’-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. По этой причине те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток узнать последовательность включения BrdU, ᴛ.ᴇ. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.

Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами репликации образуют т.н. кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.

Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, к примеру, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (к примеру, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) – места самой поздней репликации.

Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.

Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).

Τᴀᴋᴎᴍ ᴏϬᴩᴀᴈᴏᴍ, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует строгая последовательность появления в ходе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.

Основные белки хроматина – гистоны. Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. При этом для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер крайне важно иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 103--1 х 104. И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не бывают осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.

В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счёт солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.

Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом. До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.

Гистоны – белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких базовых аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в данном случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. По этой причине хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).

Гистоны – наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5).

Таблица 5. Общие свойства гистонов млекопитающих

Гистоны – относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных базовых аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).

Два других гистона H 2 A и H 2 B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.

Гистон H 1 , представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. При этом их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.

Для гистонов всех классов (особенно для H 1) характерно кластерное распределение базовых аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах молекул. Срединные участки молекул гистонов образуют несколько (3-4) a-спиральных участка, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-видимому, богатые положительными зарядами неспирализованные концы белковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК.

У гистона H 1 наиболее вариабельным является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а C-конец, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.

В процессе жизнедеятельности клеток могут происходить посттрансляционные изменения (модификации) гистонов: ацетилирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов должна быть обратимым. Эти модификации значительно меняют свойства гистонов, их способность связываться с ДНК. Так повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и деконденсацией хроматина.

Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде, ᴛ.ᴇ. синтез гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гисонов останавливается. Включившиеся в хроматин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.

Подразделение гистоноы на пять групп и достаточное сходство их внутри каждой группы в целом характерно для эукариот. При этом целый ряд отличий в составе гистонов наблюдается как у высших, так и у низших эукариотических организмов. Так у низших позвоночных вместо H1, характерного для всех тканей этих организмов, в эритроцитах находят гистон H5, который содержит больше аргинина и серина. С другой стороны, наблюдается отсутствие некоторых групп гистонов у ряда эукариот, и в целом ряде случаев полная замена этих белков на другие.

Гистоноподобные белки были обнаружены в составе вирусов, бактерий, митохондрий. Так, к примеру, у E. coli в клетке в большом количестве обнаруживаются белки (HU и H-NS), по аминокислотному составу напоминающие гистоны.

Функциональные свойства гистонов. Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отдаленных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом, все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга группы гипотез о функциональной роли гистонов, о регуляторной и структурной их роли.

Было обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-полимеразы должна быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности выделенной чистой ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда можно было сделать вывод, что общее содержание гистонов может регулировать уровень транскрипции. Это наблюдение совпадает с тем, что по мере удаления гистонов, особенно H1, происходит прогрессивная деконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчает взаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено, что модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашивается вывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. При этом оставался открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках. Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как H 1 или как H 2 A и H 2 B, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.

Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов в организации хроматина. Так постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к его переходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит к образованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующей роли гистонов. Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНК уложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров, молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностью упаковки равной 1: 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНК существуют несколько уровней упаковки, первые из которых прямо определяются взаимодействием гистонов с ДНК.

Первый уровень компактизации ДНК. В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.

На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти

Структура и химия хроматина - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Структура и химия хроматина" 2017, 2018.

ХРОМАТИН - материальный субстрат хромосом, представляющий собой многокомпонентную систему молекул, находящихся в определенных пространственных, химических и физических взаимоотношениях.

Основным структурным и химическим компонентом хроматина служит комплекс дезоксирибонуклеиновой кислоты (см.) с гистонами (см.) и негистоновыми белками (см. Нуклеопротеиды), иногда - с протаминами (см.). Другие компоненты хроматина - РНК (см. Рибонуклеиновые кислоты), липиды (см.), углеводы (см.), неорганические вещества прямо или косвенно связаны с белками (см.). Количественные соотношения компонентов хроматина существенно зависят от типа клеток; их относительное содержание чаще всего соответствует следующим величинам: ДНК 30-45%, гистоны 30-50%, негистоновые белки 2-35%, РНК и другие компоненты 1 -10%.

Термин «хроматин» был введен в 1880 году немецким ученым В. Флеммингом для обозначения окрашивающихся структур фиксированных ядер клеток (за исключением ядрышек). Преобладающая часть таких структур окрашивается основными красителями (базохроматин), а некоторые - кислотными (оксихроматин). Выделяемые в ядре хроматиновые структуры имеют вид глыбок или сети фибрилл, различающихся в одной клетке и в клетках разных объектов по степени дисперсности. Наиболее интенсивно окрашивающиеся глыбки - хромоцентры (кариосомы) иногда называли ложными ядрышками. Хромо центры имеют, по-видимому, повышенную адгезивную способность, поскольку они легко входят в контакт с ядерной оболочкой, а также агрегируют друг с другом.

Структура хроматина в ядрах интерфазных клеток, то есть клеток, находящихся в периоде между следующими друг за другом митозами (см.), зависит от стадии развития организма (см. Онтогенез , Эмбриональное развитие). У ряда исследованных объектов в первых 2-4-х бластомерах хроматиновые структуры не выявляются, на стадии 8-10 бластомеров в ядре выявляются мелкие хроматиновые глыбки, приобретающие в неделящихся дифференцированных клетках высокоспецифичный характер для каждого типа клеток (см. Деление клетки). В процессе старения этих клеток наблюдают усиление конденсации хроматина.

Изоэлектрическая точка (см.) хроматина зависит от количества белков, входящих в комплекс с ДНК, и находится в интервале значений pH 3,0-5,0. Патологические изменения хроматина как морфологические структуры сопровождаются изменениями pH, при которых находится изоэлектрическая точка. Это отмечают, например, при воздействиях ионизирующего излучения, старении и др. При различных патологических состояниях может меняться и степень дисперсности хроматина. Так, опухолевые клетки характеризуются наличием большого числа хромоцентров, имеющих иногда достаточно крупные размеры; при болезни Дауна (см. Дауна болезнь) хроматин по сравнению с нормой более конденсирован, изменены константы его связывания с красителями; при синдроме Блума (см. Пойкилодермия) хроматин имеет пылевидную или сегментированную структуру. При некоторых видах патологии отмечено усиление конденсации хроматина и концентрация его крупных глыбок на внутренней поверхности ядерной оболочки (гиперхроматоз).

Структуры хроматина и половой хроматин (см.) наблюдают с помощью световой микроскопии. Форма и размер этих структур зависят от способа фиксации клеток. Это свидетельствует о том, что выявляемая после фиксации морфология хроматина отражает не его истинную структуру в живой клетке, а лишь возможность разных способов его организации. В ядрах живых клеток, как правило, компоненты, соответствующие хроматиновым структурам, не выявляются. Однако незначительные повреждения (раздражения) в ряде случаев приводят к обратимому появлению таких структур в прежде гомогенном ядре (напр., при воздействии наркотических анальгетиков и др.). Известен и противоположный эффект - обратимая «гомогенизация» структур, выявляемая в норме в ядрах живых клеток. Естественно, что оптическая гомогенность ядра не тождественна структурной гомогенности хроматина на уровнях более низких, чем позволяет видеть разрешающая способность световой микроскопии. Поэтому сейчас термин «хроматин» утрачивает свое морфологическое содержание, его чаще относят к химическому субстрату хромосом (см.) - сложному комплексу биополимеров. Организующие этот комплекс в единую систему в основном слабые (нековалентные) взаимодействия, равно как и конформация (см.) образующих его молекул, существенным образом зависят от хим. состава, количественного соотношения взаимодействующих компонентов и внешних факторов. Это определяет возможность различных способов организации комплекса в целом и (или) благодаря структурной динамике организации его отдельных структурных компонентов. Полагают, что набор таких способов организации (состояний) ограничен, а переходы между ними имеют характер фазовых переходов. Реализация состояния хроматина, по тем или иным причинам не соответствующего состоянию данной клетки в норме, является признаком патологии.

Установлено существование, по крайней мере, двух классов хроматина: 1) эухроматина, который деконденсируется во время интерфазы и конденсируется в митозе; 2) гетерохроматина, который остается компактным не только в митозе, но и в интерфазе, где его микроскопически идентифицируют в виде хромоцентров. Эухроматин является основной информационной частью генома, в которой преимущественно локализованы структурные гены с соответствующими регуляторными областями. Для гетерохроматина характерна поздняя репликация (см.) ДНК, входящей в его состав. В отличие от эухроматина гетерохроматин в структурном отношении более лабилен: иногда наблюдают его деконденсацию при голодании, действии низких температур и др. Установлено, что при воздействии ряда мутагенных факторов (см. Мутагены) химической и физической природы структурные повреждения чаще локализуются в гетерохроматиновых областях хромосом. Различают два типа гетерохроматина. Первым из них является структурный, постоянно конденсированный хроматин. Как правило, в нем не содержится генов (см. Ген), его ДНК представлена в основном короткими повторяющимися нуклеотидными последовательностями (у некоторых организмов - сателлитной ДНК). При пространственном сближении в результате хромосомных перестроек участков структурного гетерохроматина и эухроматина в ряде случаев ингибируется фенотипическое проявление генов (так называемый эффект положения гена). Активация генов, локализованных в эухроматине, при пространственном разобщении последнего с гетерохроматином может быть, согласно некоторым представлениям, одной из причин активации онкогенов, локализованных в ДНК хромосомы. В целом роль структурного гетерохроматина недостаточно ясна. Полагают, что он существен для процессов конъюгации хромосом (см.), взаимного расположения хромосом в ядре, прикрепления участков хромосом к ядерной оболочке, укладки хроматиновых фибрилл, защиты жизненно важных элементов хромосом, сближения ядрышкообразующих хромосом, эволюции кариотипа и др. Таким образом, предполагаемая роль структурного гетерохроматина заключается в регуляции пространственной организации и соответственно - функциональной активности хромосом.

У человека структурный гетеро-хроматин локализован в центромерных участках всех хромосом, в районах вторичных перетяжек хромосом 1, 9, 16-й пар, коротких плечах акроцентрических хромосом, в дистальной части длинного плеча Y -хромосомы и обрамляет блоки генов рибосомной РНК (ядрышкообразующие районы). На долю структурного гетерохроматина у человека приходится 10-15% всего хроматина. У разных лиц количество структурного гетерохроматина варьирует даже в пределах гомологичных хромосом. Обнаружено, что полиморфные варианты структурного гетерохроматина (см. Полиморфизм в генетике) у людей могут коррелировать с некоторыми наследственными заболеваниями, а возможно определять их или указывать на предрасположенность к ним.

Вторым типом гетерохроматина принято считать факультативный гетерохроматин, или инактивированный эухроматин. Этот тип хроматина сходен с гетерохроматином только в морфол. отношении: микроскопически он выявляется в интерфазном ядре в виде интенсивно красящихся глыбок разного размера. Основываясь на молекулярной организации и функциях, его правильнее считать одним из типов эухроматина. Он содержит структурные гены, фенотипически инактивированные путем конденсации (гетерохроматини-зации) эухроматина. Одним из типичных примеров факультативного гетерохроматина являются тельца Барра (X-хроматин).

Таким образом, функционирование хроматина как системы, в которой происходит начальный этап реализации наследственной информации, в значительной степени определяется пространственным распределением ее взаимозависимых конденсированных и де-конденсированных зон (согласно представлениям о физических процессах, лежащих в основе самоорганизации пространственной структуры хроматина,- микрофазовое расслоение системы). Распределение конденсированных и деконденсированных зон является отражением состояния системы в целом, что не исключает, однако, относительной автономности этих участков в ряде процессов. Известны случаи, когда путем конденсации хроматина осуществляется инактивация целых хромосом (например, одной из X-хромосом у женщин) или почти всего генома (напр., в эритроцитах птиц). В большинстве типов клеток доля активного хроматина составляет 2- 15%. По данным молекулярно-биол. анализа, в ряде случаев инактивация связана с появлением определенных подфракций гистона Н1 или замещением последнего другими гистонами, в частности гистоном Н5 (см. Нуклеопротеиды). В сперматозоидах некоторых животных репрессия генома реализуется на фоне замещения гистонов протаминами или подобными им белками.

Существенную роль в организации транскрипции (см.), в том числе через дифференциальную деконденсацию хроматина, отводят негистоновым белкам хроматина (НГБ). В их число входят также ферментные комплексы, ответственные за репарацию (см. Репарация генетических повреждений), репликацию, транскрипцию и модификацию нуклеиновых кислот (см.) и за некоторые ферментативные превращения ряда хромосомных белков. В ядрах клеток, в которых не происходит активной транскрипции, количество негистоновых белков хроматина существенно уменьшено. Например, зрелые гаметы в значительной степени освобождены от таких белков. Полагают, что в организации или поддержании транскрипции принимают участие негистоновые белки хроматина, прочно связанные с ДНК, среди которых, по-видимому, находится компонент, специфически связывающий комплекс гормон - рецептор, а также тесно связанные с нуклеосомами белки HMG14 и HMG17. Последние способны ингибировать деацетилирование гистонов, а этот процесс наряду с недометилированием ДНК представляет собой модификации, характерные для компонентов активных участков хроматина.

Важным для структурных переходов хроматина является способность белка хроматина А24 к расщеплению на гистон Н2а и полипептид убиквитин. Общей характеристикой участков транскрипционно активного хроматина из разных источников является повышенная чувствительность их ДНК к воздействию ряда нуклеаз (см.). При активации транскрипции такая чувствительность распространяется на участок молекулы ДНК в составе хроматина по протяженности примерно на два порядка больше, чем занимает ген. Все изложенное выше свидетельствует о значении в организации транскрипции более высоких уровней упаковки хроматина, чем его элементарная фибрилла, видимая в электронный микроскоп. Последняя при участии гистона Н1, расположенного наряду с негистоновыми белками хроматина HMG1 и HMG2 в основном на межнуклеосомной ДНК, представляет волокно диаметром около 10 нм. При этом монотонность нуклеосомной организации дезоксирибонуклеопротеидного (ДНП) волокна может нарушаться благодаря структурной динамике нуклеосом (см. Клетка), модификации гистонов при их фосфорилировании, ацетилировании, метилировании и рибозилировании.

Существенную роль отводят меж-молекулярным контактам, способным регулировать конденсацию ДНК на уровне нуклеосом. Нек-рые структурные переходы нуклеосом происходят при изменении ионной силы среды. В ядре клетки количество низкомолекулярных противоионов (ионов К+, Na+ и др.) по порядку величины равно числу фиксированных на макромолекулах (например, фосфатные группы ДНК) зарядов. Поэтому небольшие колебания в абсолютном количестве низкомолекулярных противоионов в ядре (например, при увеличении или уменьшении объема последнего) должны вызвать структурные переходы нуклеосом. Наконец, гистон Н1 может замещаться другими гистонами или их комплексами, имеющими большее сродство к ДНК, с соответствующей реорганизацией структуры фибриллы. Таким образом, возможность различных способов упаковки хроматина заложена уже на уровне различных полиморфных структурных вариантов элементарной фибриллы хроматина. Стабильность следующего уровня организации хроматина - неравномерных по диаметру (20-30 нм) фибрилл - обеспечивается, по-видимому, и гистоном Н1. Дальнейшая упаковка хроматиновых фибрилл реализуется, как полагают, путем самоорганизации системы с образованием конденсированных (глобулярных) зон и петель или независимых суперспирализованных областей (доменов). Домены характеризуются участком двойной спирали ДНК, специальным образом расположенным в пространстве, концы этой двойной спирали фиксированы, что ограничивает или исключает возможность ее вращения. Длина петли ДНК по контуру для разных объектов соответствует мол. весу (массе) ДНК порядка 10 000000- 100 000000. Изменение степени суперспирализации ДНК является еще одним важным фактором регуляции процессов экспрессии генов (см. Экспрессивность гена) через модификацию надмолекулярных систем хроматина. Суперспирализация ДНК изменяется также при действии ионизирующего излучения, некоторых химических соединений, активации нуклеаз и др. Указанные факторы вызывают однонитевые разрывы в молекулах ДНК, что приводит к релаксации в отдельных петлях ее исходной суперспиральной структуры. Этот процесс может вызывать перераспределение белков хроматина, поскольку ряд белков имеет различные константы связывания с линейной, кольцевой и суперспиральной ДНК.

Воздействие агентов, вызывающих диссоциацию белков, в частности гистонов хроматина (некоторые химимечсие мутагены, ионизирующие излучение, высокие концентрации солей, ионов водорода и др.), также приводит к изменению степени суперспиральности, поскольку сам процесс образования нуклеосом связан с реорганизацией суперспирали ДНК.

Полагают, что динамические возможности структуры хроматина нельзя рассматривать только как один из факторов, регулирующих транскрипцию. Действие всех остальных факторов регуляции, как внутри-, так и внеклеточных, реализуется через создание структуры хроматина, специфичной для каждого типа клеток, различающихся по характеру синтеза РНК. В этой связи все воздействия, изменяющие нормальные взаимоотношения между компонентами хроматина и тем самым - его структуру, должны приводить к патологическому функционированию этой системы. Существенное значение имеют изменения структуры хроматина, предрасполагающие к последующему генетическому неблагополучию. Так, полагают, что важное значение может иметь реализация состояний хроматина, при которых снижена вероятность узнавания ферментами репарации повреждений ДНК - явления, которое, по-видимому, служит одной из ведущих причин феномена нестабильности хромосом и характерной для них группы наследственных болезней (см. Хромосомные болезни). Отмечена связь некоторых изменений структуры хроматина с увеличением частоты конъюгации негомологичных хромосом - одной из возможных причин анеуплоидий (см. Мутация). При действии генетически опасных агентов на клетки и организмы кроме генетических повреждений самой ДНК (генные мутации) и указанных выше перестроек структуры хроматина как системы возникают многочисленные нарушения во взаимодействиях между компонентами хроматина: частичная диссоциация белков хроматина, образование межмолекулярных «сшивок» между ДНК и белками, распад фибриллы хроматина на нуклеосомы и др., что в свою очередь усиливает патологический эффект такого агента.

Библиогр.: Андрееве. Г. и Спитковский Д. М. Биофизические модели самоорганизации пространственной структуры хроматина, Докл. АН СССР, т. 269, № 6, с. 1500, 1983; Г е о р г и е в Г. П. и БакаевВ. В. Три уровня структурной организации хромосом эукариот, Молек. биол., т. 12, № 6, с. 1205, 1978, библиогр.; H е й ф а х А. А. и Т и м о ф e е в а М. Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития, М., 1978; Прокофье-ва-Бе льговская А. А. Значение негистоновых белков в преобразованиях и генетическом функционировании хромосом, Молек. биол., т. 16, Na 4, с. 771, 1982; Теоретические проблемы медицинской генетики, под ред. А. Ф. Захарова, с. 52, М., 1979; Chromatin structure and function, ed. by C. A. Nicolini, N. Y. -L., 1979.

Д. М. Спитковский, H. А. Ляпунова.