Определение активности каталазы в растительном материале. Выявление органических веществ

Приложение №1.

И н с т р у к ц и я по проведению лабораторной работы.

Лабораторная работа №3

Тема:

Цель: сформировать знания о роли ферментов в клетках; выяснить ферментативные свойства белков-пероксидаз; закрепить умение работать с микроскопом; проводить опыты и объяснять результаты работы.

Оборудование: свежий 3%-ный раствор пероксида водорода, пробирки, пинцет, ткани растений (кусочки сырого и варёного картофеля) и животных (кусочки сырого и варёного мяса), песок, ступка и пестик.

Дополнительные сведения: пероксид водорода образуется в клетке в процессе обмена веществ, обладает мутагенным действием. Н2О2 - вещество химически нестойкое и способно самопроизвольно разлагаться с образованием устойчивых соединений: 2 Н2О2 = 2 Н2О + О2

Х о д р а б о т ы.

1. Приготовьте четыре пробирки со свежим 3%-ный раствором пероксида водорода, затем поместите в первую пробирку кусочек сырого картофеля, во вторую – кусочек варёного картофеля, в третью – кусочек сырого мяса, в четвёртую – кусочек варёного мяса. Пронаблюдайте, что будет происходить в каждой пробирке.

2. Составьте таблицу, показывающую активность каждой ткани при различной обработке.

3. Измельчите в ступке кусочек сырого картофеля с небольшим количеством песка. Перенесите измельчённый картофель вместе с песком в пробирку и капните туда немного пероксида водорода. Сравните активность измельчённой и целой растительной ткани.

4. Объясните полученные результаты.

Ответьте на вопросы:

Как проявляется активность ферментов в живых и мёртвых тканях?

Различается ли активность ферментов в растительных и животных тканях?

Как влияет измельчение ткани на активность фермента?

Как бы вы предложили измерить скорость разложения пероксида водорода?

Как вы считаете, все ли живые организмы содержат фермент пероксидазу,

обеспечивающий разложение пероксида водорода?

Образец отчёта по лабораторной работе

«Каталитическая активность ферментов в живых тканях»

Вывод: действие ферментов-пероксидаз сходно в растительных и животных клетках, общность физиологических процессов – одно из доказательств родственных связей между растительными и животными организмами.

Введение

Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:

1. Методы определения активности ферментов.

2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.

3. Методы выделения и очистки ферментов.

4. Изучение субклеточной локализации ферментов.

5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.

Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.

Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):

Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин - (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.

2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

Ферменты

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, образуемые любой живой клеткой и обладающие способностью активизировать различные химические соединения.

Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации. Так, реакция АВ А + В в присутствии фермента идет следующим образом: АВ+Ф→АВФ; АВФ→А+ВФ; ВФ→В+Ф. →

Все ферменты разделяют на два большие класса: однокомпонентные и двухкомпонентные.

К первому классу относятся ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу - ферменты, которые состоят из белка и связанной с ним небелковой части, так называемой активной группой. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент, или простетическая группа. У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных или каталитических центров.

Одним из свойств ферментов, отличающихся от свойств неорганических катализаторов, является их большая лабильность - зависимость от ряда воздействий: концентрации водородных ионов, температуры, окислительно-восстановительных условий, концентрации некоторых соединений (продуктов обмена веществ), ионов металлов и т.п.

Вторая весьма существенная особенность каталитического действия ферментов состоит в том, что оно строго специфично, то есть действие ферментов направлено на совершенно определенные химические связи.

По характеру своего каталитического воздействия ферменты разделяются на шесть классов:

1) оксидоредуктазы или окислительно-восстановительные ферменты;

2) трансферазы, т.е. ферменты, катализирующие перенос различных групп атомов с одной молекулы на другую;

3) гидролазы, катализирующие гидролитические реакции;

4) лиазы - ферменты, которые отщепляют от субстратов ту или иную группу (не путем гидролиза) с образованием двойной связи или наоборот, присоединяют к двойным связям;

5) изомеразы, т.е. ферменты, катализирующие реакции изомеризации органических соединении;

6) лигазы или синтетазы - к этому классу принадлежат ферменты, которые катализируют синтетические реакции.

Каждый из этих классов подразделяется на подклассы, а эти последние, в свою очередь, на более мелкие группы.

На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.

В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.

Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить индикатором для контроля процесса сушки.

Исключительно велико биологическое значение амилаз при созревании и прорастании зерна, а также в ряде технологических процессов пищевых производств, имеющих в своей основе гидролитические превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.

В зерне злаковых культур содержится два специфических фермента, обусловливающих гидролиз крахмала, а именно:

1) -1,4 - глюкангидролаза или αα-амилаза, гидролизующая α-1,4 - глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно;

2) -1,4 – глюканмальтогидролаза или αβ – амилаза, гидролизующая α-1,4 – глюкановые связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей.

Несмотря на то, что протеазы имеют не менее важное значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения (ферментов, гидролизующих белки) оказались малоэффективными при изучении протеолитических ферментов зерна злаков. Под влиянием протеаз происходят разжижение клейковины, что, в свою очередь, приводит к ухудшению качества выпекаемого хлеба.

Липазы вызывают гидролиз жиров, т.е. расщепляют сложные эфиры глицерина с образованием свободных жирных кислот, в результате чего повышается кислотность зерна и муки.

При участии липоксигеназ происходит окисление непредельных жирных кислот, образуются низкомолекулярные карбонильные и карбоксильные соединения, обладающие неприятным запахом и горьковатым вкусом. Этот процесс называют прогорканием жиров (муки).

Лабораторная работа №1.

Тема: Культивирование микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Цель работы: Выращивание продуцентов различных ферментов на твердых сыпучих средах и проведение анализа полученных культур на активность содержащихся в них ферментов.

Метод поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислород непосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы (анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих – для производства ферментных препаратов.

1.Подготовка посуды и ее стерилизация;

2.Приготовление питательной среды и ее стерилизация;

3.Расчет количества воды, необходимой для увлажнения питательной среды;

4.Увлажнение стерильной питательной среды, ее засев и раскладка в кюветы для выращивания;

1.Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена в сушильном шкафу.

Для стерилизации следует завернуть в бумагу, и аккуратно завязать веревочками следующие предметы: кювету, крышку к кювете.

Стерилизацию посуды и воды следует проводить в автоклаве при температуре 120ºС в течение 0,5 ч.

Стерильная посуда после автокловирования должна быть подсушена в сушильном шкафу при 105 ºС, так как бумага при стерилизации слегка увлажняется.

2. Приготовление и стерилизация питательной среды. Для каждого микроорганизма готовится своя питательная среда, обеспечивающих биосинтез определенных ферментов.Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно. Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо многослойную салфетку из марли, либо в широкий стеклянный стакан. Для Asp. oryzae, например, используется следующие варианты питательных сред: пшеничных отрубей-100,70; солодовых ростков-30; свекловичного жома-50; выжимок винограда-20; солодовых ростков-50; рисовой шелухи-50.

3. Для нормального развития микроскопического гриба и интенсивного образования ферментов необходимо, чтобы среда имела влажность 58-63%.

Расчет количества добавляемой воды проводится по следующим данным:

Acp- масса питательной среды с исходной влажностью;

Сср- масса питательной среды с требуемой влажностью;

Гср- масса питательной среды после стерилизации;

Д- количество воды, которое необходимо добавить для получения питательной среды требуемой влажности.

Лабораторная работа №2

Тема: Экстрагирование ферментов, выращенных поверхностным способом

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов поверхностным способом на твердых питательных средах.

Метод экстрагирования поверхностных культур . Поверхностное культивирование аэробов проводят на плотной или сыпучей среде, а также в тонком слое жидкой среды в стеклянной посуде с широким дном: чашках Петри, колбах Виноградского, матрацах, кюветах. Засеянные сосуды выращивают при постоянной температуре в термостатах или термостатных комнатах (термокамерах). Микроорганизмы развиваются на поверхности среды и используют кислороднепосредственно из воздуха. На жидких средах облигатные аэробы растут в виде обильных пленок. Факультативные аэробы(анаэробы) развиваются как в толще жидкой среды, образуя суспензии, хлопья, осадок, так и на поверхности в виде тонкой пленки. На плотных средах микроорганизмы растут в виде отдельных колонии или сплошным газоном. Поверхностное культивирование в лабораторных условиях широко применяют для получения накопительных и чистых культур, их хранения, изучения морфологических, культуральных и биохимических признаков микроорганизмов. В промышленности метод поверхностных культур на жидких средах используют для получения лимонной кислоты, на сыпучих- для производства ферментных препаратов.

В данной лабораторной работе удобнее всего использовать микроскопические грибы или дрожжеподобные микроорганизмы, например такие, как Asp niger. Rh. Delemar и др.

Лабораторная работа №3

Тема: Культивирование микроорганизмов глубинным способом.

Цель работы: Уметь культивировать микроорганизмов глубинным способом.

Глубинное культивирование. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом процессе весь объем питательной среды засевают посевным материалом и выращивание ведут в оптималных условиях определенный промежуток времени, пока не накопится нужное количество биомассы или целевого продукта. Для обеспечения роста аэробных культур в глубоких слоях жидкости необходимо поступление кислорода. Так как микробные клетки способны использовать только растворенный кислород, а растворимость его невелика(4-7 мг/г)

Простым и доступным способом периодического глубинного культивирования является выращивание аэробных культур в суспендированном состоянии в жидкой среде, разлитой в небольших объемах в пробирки и колбы.

Непрерывное глубинное культивирование ведут в лабораторных ферментаторах. Процесс непрерывного выращивания в ферментаторе осуществляется по типу хемостата или турбидостата.

Целью настоящей работы является выращивание продуцентов различных ферментов на жидких питательных средах глубинным способом и анализ получаемых культур микроорганизмов на содержание в них определенных ферментов.

Как в первой лабораторной работе необходимо полуичть посевной материал, который готовят, выращивая продуцент в несколько пассажей на агаризованных средах в пробирках или матрацах.

В лабораторной работе студент готовит 0,7дм 3 питательной среды. Первоначально на технических весах взвешивается стакан, а затем в стакан отвешиваются все необходимые компоненты среды. Жидкие компоненты среды отмериваются по объему.

Соли растворяются без особых предосторожностей. Крахмал или мука смешиваются в соотношении 1:10 с холодной водой и завариваются на кипящей водяной бане.

Варианты питательных сред для культивирования микроорганизмов- продуцентов ферментов.

Таблица 1

Для каждого варианта берут по четыре колбы, в каждую наливают по 120 см 3 приготовленной среды. Колбы закрывают ватными пробками, пробки прикрывают бумажными плотными колпаками, чтобы онине увлажнялись при стерилизации. Одновременно с качалочными колбами на стерилизацию ставят колбу с 50 см 3 среды для последующего определения ее рН.

Определения рН среды

рН среды определяют электрометрическим методом дважды: до и после стерилизации, осуществляется каждый раз по три повторности этих определений и анализируя затем достоверность этих результатов.

Засев питательной среды

После того как стерилизация окончена и автоклав открыт, пипетки помещают на 10-15 мин. В горячий сушильный шкаф для подсушивания бумаги, колбы и остальные посуды оставляют в автоклаве на 10-15 мин. Засев питательной среды проводят в боксе.

Лабораторная работа №4

Определение активности каталазы

Каталаза относится к первому классу ферментов (оксидоредуктаз) и катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и кислород по уравнению:

Каталаза играет важную роль в жизнедеятельности организмов, так как она разрушает ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Количественное определение каталазы основано на учете перекиси водорода путем титрования ее перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:

2KMnO 4 + 5H 2 O 2 + 4H 2 SO 4 2KHSO→ 4 + 2MnSO 4 + 8H 2 O + 5O 2

О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств 0,1 моль/дм 3 раствора КМnО 4 , израсходованных на титрование в контрольном и рабочем опытах.

Испытуемый материал: солод (проросшее зерно)

Реактивы: раствор перекиси водорода ω (H 2 O 2) = 1 %

раствор серной кислоты ω (H 2 SO 4) = 10 %

раствор перманганата калия С (1/5 KMnO 4) = 0,1 моль/дм 3

5 г испытуемого материала настаивают при комнатной температуре в течение 30 минут со 100 см 3 воды, периодически перемешивая содержимое колбы. После настаивания жидкость отфильтровывают через сухой складчатый фильтр и из прозрачного раствора отбирают пипеткой две порции по 20 см 3 (одна опытная и одна контрольная) и переносят каждую в отдельную коническую колбу на 200 см 3 . Контрольную кипятят 3 мин для инактивации фермента.

К опытной и контрольной пробам прибавляют по 20 см 3 дистил-лированной воды, по 4 см 3 перекиси водорода, и оставляют на 20 мин при комнатной температуре для действия фермента. По истечении 20 мин к пробам прибавляют по 5 см 3 серной кислоты, и оставшуюся (не разложившуюся) перекись водорода титруют раствором перманганата калия.

Активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложившейся под действием фермента за 1 мин в расчете на 1 г исследуемого материала.

Активность каталазы определяют по формуле:

где Х – активность каталазы;

а - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование контрольного раствора, см 3 ;

b - количество 0,1 моль/дм 3 раствора KMnO 4 , израсходованного на титрование опытного раствора, см 3 ;

К – поправка к титру;

100 – общий объем экстракта, см 3 ;

50 – коэффициент пересчета на микромоли H 2 O 2 ;

20 – объем ферментного раствора, см 3 ;

20 – время ферментативной реакции, мин;

Р - навеска испытуемого материала, взятого для анализа, г.

Лабораторная работа №5.

Колориметрический метод определения активности α- и β-амилазы

Под действием амилаз в растениях происходит гидролиз высоко-полимерного углевода - крахмала - с образованием декстринов и мальтозы. В растениях встречаются α- и β-амилазы.

Раздельное количественное определение активности α- и β-амилаз основано на их различной термостабильности: β-амилаза разрушается нагреванием до 70 °С, α -амилаза при этом сохраняет свою активность.

Методы определения активности амилазы основаны либо на учете количества сахара, образовавшегося при действии фермента на крахмал, либо на учете количества нерасщепленного ферментом крахмала, которое определяют фотометрически после обработки раствором иода.

Реактивы: ацетатный буфер с рН 5,5;

раствор хлорида натрия ω (NаСl) =1 %;

раствор крахмала ω = 10 % , (2 г крахмала, размешанного в 20 см 3 холодной воды, выливают в 80 см 3 кипящей воды, после чего нагревают на кипящей водяной бане до просветления раствора);

раствор соляной кислоты С(HCl) =1 моль/дм 3

раствор соляной кислоты С(HCl) =0,1 моль/дм 3

раствор йода ω = 0,3 % в 3 %-ном растворе йодистого калия.

Навеску 0,5 - 1 г муки или проростков растирают в ступке с небольшим количеством 1 %-ного раствора NаСl и переносят в коническую колбу на 50 см 3 . Соотношение между навеской и раствором NаСl 1:10 или 1:20. Содержимое колбы хорошо перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем фильтруют через плотный складчатый фильтр. При трудном фильтровании можно сочетать фильтрование и центрифугирование при 4000-5000 об/мин. Прозрачный раствор используют как ферментный препарат.

Для определения активности α- и β-амилазы берут 4 пробирки (2 опытные и 2 контрольные) и вносят в них по 3 см 3 ацетатного буфера и 3 см 3 2%-ного раствора крахмала. Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до 40°С. Затем в опытные пробирки вносят по 0,2-1,0 см 3 ферментного препарата (в зависимости от активности амилаз в объекте изучения), а в контрольные - такое же количество Н 2 О. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 40 °С на 30 или 60 мин. После инкубации в каждую пробирку сразу приливают по 2 см 3 1 н. раствора НСl для прекращения действия амилаз.

Для выявления непрореагировавшего с ферментом крахмала проводят реакцию с йодом. В мерные колбы на 50 см 3 приливают около 30 см 3 воды, 1 см 3 0,1 н. НСl, 5 капель 0,3 %-го раствора иода и вносят из каждой пробирки по 0,5 см 3 смеси. Содержимое колб хорошо перемешивают, доводят до метки водой и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре или на спектрофотометре при 595 нм в кювете с рабочей длиной 1 см.

Для определения активности α-амилазы в коническую колбу на 100 см 3 приливают 5 см 3 фильтрата (ферментного препарата), добавляют на кончике ножа сухого уксуснокислого кальция и выдерживают в течение 15 мин в ультратермостате или на водяной бане при 70°С (допускаются колебания температуры не более 0,5°С). Затем содержимое колбы быстро охлаждают в сосуде с холодной водой. При таком прогревании β -амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Далее определение α -амилазной активности сводится к описанной выше процедуре.

Действие обоих ферментов выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала в условиях опыта (за 30 мин или 1 ч) на 1 г муки (проростков). Активность β-амилазы определяют по разности между суммарной активностью α- и β-амилаз и активностью α-амилазы. Активность амилаз на 1 г муки за 1 ч рассчитывают по следующей формуле:

где D - оптическая плотность контрольного раствора;

D 1 - оптическая плотность опытного раствора;

а - количество внесенного крахмала (60 мг);

m - масса навески, г;

V - объем исходной ферментной вытяжки, см 3

V 1 - объем вытяжки, взятой для инкубирования, см 3 .

Лабораторная работа № 6

©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-02-13

Принцип метода: молибденовокислый аммоний с раствором перекиси водорода образует комплексное соединение желтого цвета. Каталаза разрушает перекись водорода по следующей формуле:

2Н 2 О 2 = 2Н 2 О + О 2

Степень снижения интенсивности окраски раствора пропорциональна активности каталазы.

Ход работы: в опытную и контрольную пробирку вносят по 4 мл 0,03% раствора перекиси водорода, в опытную пробирку добавляют 0,2 мл гемолизированной крови (разведение 1:1000). Ингибируют пробу 20 минут при 37 0 С. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл раствора молибдата аммония, а в контрольную – дополнительно 0,2 мл гемолизата. Перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробы против воды при синем светофильтре. Определяют активность каталазы по формуле:

(Е к – Е 0) . 5600

А= -------------------, где

А –активность каталазы (мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл крови);

Е к –экстинция контроля; Е 0 – экстинция опыта;

В – время инкубации, мин; 5600 – коэффициент

В норме активность каталазы составляет 135 мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл

крови (в слюне –12-16 мкмоль). Активность каталазы в крови может снижаться при анемии, опухолевом росте, туберкулезе, некоторых других заболеваниях, а повышаться при острых воспалительных процессах (в слюне – при воспалительных процессах слизистой ротовой полости).

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН 3 - СН 2 - СН 2 - ОН ®

СН 3 - СН 2 - СН = О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН 3 - СН 2 - СН = О ® СН 3 - СН 2 – СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции. Как пояснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении?

4. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением вне организма? Назовите внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме. Назовите отличия между этими процессами.

5. Напишите реакции дегидрирования соединений:

R-СН 2 –СН 2 - R; R-СН=О; R- СНОН -R; R-СН=СН-R

6. Установите соответствие:

Редокс-потенциал: А.+0,82; Б. +0,10; В.+ 0,25; Г.- 0,22

Компонент ЦПЭ: 1.Убихинон; 2.Кислород; 3.ФМН; 4.Цитохром

7. Какие из перечисленных соединений являются субстратами ФАД-зависимой дегидрогеназы: глюкоза, сахароза; янтарная кислота; глицериновый альдегид, НАДН + .

8. Напишите схему переноса электронов и протонов от изоцитрата на кислород (изоцитратдегидрогеназа – НАД-зависимый фермент) и укажите

название всех ферментных комплексов.

9. Лекарственные препараты – производные барбитуровой кислоты:

А. Оказывают снотворное действие.

Б. Активируют тканевое дыхание.

В. Ингибируют НАДН-дегидрогнназу.

Д. Вызывают гипоэнергетическое состояние.

Лабораторная работа № 3

Методы количественного определения активности ферментов

Работа 1. Количественное определение активности каталазы крови

(по Баху и Зубковой)

Цель – определить активность каталазы крови (по Баху и Зубковой)

Фермент каталаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) содержится в большом количестве в эритроцитах и разлагает перекись водорода с образованием кислорода и воды по уравнению:

2Н2О2 → каталаза О2 + 2Н2О

При количественном определении активности каталазы крови измеряют или количество перекиси водорода, разложенной каталазой, или количество кислорода, выделившегося при этой реакции. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.

Каталазным числом называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл крови согласно следующей реакции:

2КМnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4→2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества КМпО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Показателем каталазы называют дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

При количественном определении активности каталазы нужно сравнивать показатели каталазы, а не каталазные числа, так как фермент содержится почти исключительно в эритроцитах и притом не в гемоглобине, а в строме. Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний, таких, как рак, анемия , туберкулез и др.

Ход работы . 1. Приготовление раствора крови . В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды. 0,1 мл крови вносят в колбу с водой. Пипетку промывают несколько раз, набирая жидкость и выпуская её в мерную колбу. Доливают мерную колбу до метки водой, следовательно, кровь развели в 1000 раз и получили основной раствор крови, в 1 мл которого содержится 1 мкл крови. В этом растворе определяют каталазное число.

2. Приготовление опытных и контрольных проб . В две конические колбы на 25 мл (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного раствора крови. Контрольную колбочку кипятят в течение 2 мин для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения. После этого обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в каждую колбочку вносят точно 2 мл 1% раствора Н2О2 и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

3. Титрование и расчет . В каждую колбочку приливают по 5 мл 10% раствора Н2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки 0,1 н. раствором КМпО4 до розового окрашивания.

Рассчитывают активность каталазы, исходя из того, что на титрование контрольной колбочки, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора КМпО4, чем на титрование опытной колбочки. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой крови.

Пример расчета . Грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г. Следовательно, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 11,7 мг Н2О2. 1 мл 0,1 н. КМпО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. Н2О2; умножая 1,7 на разность между количеством миллилитров 0,1 н. КМпО4, пошедшего на титрование в контрольной и в опытной колбочках, получают количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, т. е. получают сразу каталазное число. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.

Исходя из того, что в 1 мкл крови содержится около 5 млн. эритроцитов, можно рассчитать показатель каталазы:

Вывод

Работа 2. Определение активности каталазы сырого молока

Цель – определить активность каталазы сырого молока; на основании полученных данных отнести исследуемый объект к нормальному или анормальному молоку.

В основу метода положено определение количества разложенного ферментом пероксида водорода. Каталаза - двухкомпонентный фермент, димер, гемопротеид (в активном центре имеет протогематин). Молекулярная масса фермента 225000...230000, оптимум действия находится при рН 7,0...8,0 и температуре 20...40°С (рJ – при рН 5,4...5,7). Действие каталазы проявляется уже при 0°С, нагревание до 75...80°С разрушает её.

Возможный механизм действия каталазы описывается уравнениями:

Каталаза-FеОН + Н2О2 → Каталаза-FеООН + Н2О

Каталаза-FеООН + Н2О2 → Каталаза-FеОН + О2 + Н2О

Активность каталазы выражают в стандартных (Е) и международных (нкат) единицах, а также через объём кислорода, выделившегося из определенного объема молока при определенных условиях.

Зависимость между отдельными единицами активности каталазы: 1 Е = 16,67 нкат = 6,25 см3 кислорода.

Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, содержится в альбуминовой фракции. Бактериальная каталаза накапливается в молоке при развитии микроорганизмов. Молочнокислая микрофлора каталазу не вырабатывает. Этой способностью обладают психротрофные и гнилостные бактерии. Поэтому определение активности каталазы можно использовать для контроля количества последних в молоке (она может составлять выше16,0 Е).

Повышенная активность каталазы в анормальном молоке позволяет также выявлять его примесь в сборном молоке.

Активность каталазы в свежевыдоенном молоке, полученном от здоровых животных, составляет 4,0 - 16,0 Е, в молозиве 50 - 94, в стародойном молоке – 37 - 50, в маститном - 62 Е и более.

Для определения активности каталазы используют полярографический, манометрический и перманганатометрический методы. Последний метод наиболее точен.

Сущность метода состоит в количественном определении пероксида водорода, разложенного каталазой, содержащейся в 1 см3 молока, за 1 мин при 25°С.

Неразложившийся пероксид водорода оттитровывают раствором перманганата калия в кислой среде (см. реакцию выше).

Количество разложившегося пероксида водорода находят по разнице между контрольным и опытным титрованием.

Ход работы . Перед началом работы часть исследуемого молока кипятят для разрушения каталазы.

В две конические колбы вместимостью 200 см3 пипетками вносят в первую - 2 см3 сырого молока (опытная проба), во вторую - 2 см3 кипяченого молока (контрольная проба). Температура молока (20 ± 1)°С. В обе колбы цилиндром добавляют по 98 см3 дистиллированной воды с температурой (20 ± 1)°С, содержимое колб перемешивают, колбы нагревают на водяной бане до температуры (25 ± 1)°С. Затем в обе колбы пипеткой добавляют по 25 см3 0,3%-ного раствора пероксида водорода, колбы закрывают пробками, их содержимое тщательно перемешивают; колбы помещают в термостат при температуре (25 ± 1)°С. Записывают время начала опыта.

Через 30 мин в обе колбы из бюретки вносят по 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титруют из бюретки раствором перманганата калия (Сэ = 0,1 моль/дм3) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Исчезновение окрашивания в более поздний срок связано с окислением органических составных частей молока.

Обработка результатов . Активность каталазы в стандартных единицах рассчитывают по формуле:

где Vk - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование контрольной пробы, см3;

Vo - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование опытной пробы, см3;

1,7 - масса пероксида водорода, соответствующего 1 см3 раствора перманганата калия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/дм3, мг;

m - объем молока, см3 (m = 2 см3);

t - продолжительность выдержки молока с раствором пероксида водорода, мин (t = 30 мин);

0,034 - масса 1 мкМ пероксида водорода, мг.

После подстановки известных значений формула принимает вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 0,83 (Е)

Примечание. 1 . Предлагаемая методика измерения активности каталазы рекомендуется для исследования сырого молока с активностью каталазы не выше 20 Е. 2. При исследовании анормального молока следует брать для анализа не все разведение молока (100 см3), а 20 см3. В этом случае расчетная формула будет иметь вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 4,15 (Е)

Вывод

Работа 3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

Цель – определить сукцинатдегидрогеназу мышц.

Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) очень распространена в тканях животных, растений и микроорганизмов, катализирует дегидрирование янтарной кислоты, при котором последняя превращается в фумаровую кислоту:

При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная сукцинатдегидрогеназа передает водород на метиленовую синюю, образуя бесцветное лейкосоединение:

Ход работы . В две пробирки (опытную и контрольную) помещают 2 мл гомогената мышц. Содержимое контрольной пробы кипятят и охлаждают.

В обе пробирки наливают по 1 мл фосфатного буфера рН 6,8, по 2 мл 0,01 н. нейтрализованного раствора янтарной кислоты и по 2 капли 0,05% раствора метиленовой синей.

Заливают содержимое обеих пробирок 2 мл подогретого агар-агара и кладут их на лёд для застывания. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Опыт считают законченным, когда в опытной пробирке жидкость будет почти бесцветной. В контрольной пробирке жидкость не изменяет окраску, поскольку фермент денатурируется при нагревании.

Критерием активности сукцинатдегидрогеназы является время обесцвечивания метиленовой синей в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.

Работа 4. Определение эффективности пастеризации молока пробой на

лактопероксидазу

Цель – определить активность лактопероксидазы, на основании полученных результатов отнести исследуемый объект к пастеризованному, либо непастеризованному молоку.

Способность пероксидазы выдерживать нагревание до 80°С положена в основу метода контроля высокотемпературной пастеризации молока (ГОСТ 3623-73. «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации»).

Фермент пероксидаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирует окисление различных соединений в присутствии пероксида водорода вследствие выделения активного атомарного кислорода.

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, димер, гликогемопротеид, его молекулярная масса составляет 76000 - 93000, имеет оптимум действия при рН = 6,0 - 7,0 и температуре 20 - 25°С (рJ фермента = 9,6). Фермент термоустойчив, инактивируется при температуре выше 80°С. Возможна его реактивация после нагревания. Механизм действия фермента описывается уравнением:

Н2О2 → О + Н2О

Нативная пероксидаза (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы; часть её поступает в молоко с лейкоцитами (миелопероксидаза). Фермент связан с альбуминовой фракцией молока.

В молоке содержится 3 - 10 мг% пероксидазы, в молозиве её содержание выше. Активность пероксидазы в свежевыдоенном молоке также довольно высока и составляет 370 нкат.

Лактопероксидаза вместе с тиоцианатом и пероксидом водорода входит в антибактериальную систему молока. Так, лактопероксидаза катализирует окисление тиоцианата, а образующиеся продукты (гипотиоцианат и др.) подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, особенно грамотрицательных, в том числе патогенных.

Как указывалось выше, пероксидаза расщепляет пероксид водорода с образованием активного атомарного кислорода. Активный кислород окисляет йодид калия, при этом восстанавливается йод.

При наличии крахмала в реакционной смеси она принимает сине-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 5 см3 исследуемого молока, 5 капель раствора йодкалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора пероксида водорода. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реактива. Через 2 мин анализируют окрашивание содержимого пробирки.

Оценка результатов . Если окрашивание молока в пробирке не изменилось, то фермент, пероксидаза в нем отсутствовал, следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80°С.

Появление в пробирке сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии пероксидазы. Следовательно, молоко не подвергалось пастеризации или температура пастеризации была ниже 80°С, или пастеризованное молоко было смешано с непастеризованным.

Появление окрашивания в пробирках более чем через 2 мин после добавления реактивов, не указывает на отсутствие пастеризации, так как может быть вызвано разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованного молока к пастеризованному.

Вывод

Вопросы

1. Какие вещества называются ферментами?

2. Каковы их химическая природа и свойства?

3. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?

4. Как зависит активность ферментов от температуры?

5. Как влияет величина рН среды на ферментативную активность?

6. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры

7. Какие качественные и количественные методы используются для изучения действия ферментов?

8. Что представляет собой единица активности ферментов?

9. На чем основан метод определения активности амилазы и каково диагностическое значение этого определения?

10. Как определяют активность каталазы крови?

11. Каковы основные принципы метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах?