Определение охратоксина а. Зерно и продукты его переработки, комбикормаопределение охратоксина а методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium . Основными продуцентами являются A.ochraceus и P.viridicatum . Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5ºС. Охратоксины – соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом.

Охратоксины А,В, и С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L -фенилаланином пептидной связью. В зависимости от природы радикалов образуются охратоксины различных типов (табл. 2.3.).

Охратоксин А – бесцветное кристаллическое вещество, слабо растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе карбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В УФ свете обладает зеленой флуоресценцией.

Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В УФ-свете обладает голубой флуоресценцией.

Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В У-свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.

Охратоксины принадлежат к токсичным микотоксинам, обладают высокой токсичностью для печени, почек, тератогенными и иммунодепрессивными свойствами, выраженным гемолитическим эффектом. Из охратоксинов наиболее токсичен охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (однодневные цыплята, перорально)). Он более токсичен, чем афлатоксины. Другие микотоксины этой группы на порядок менее токсичны.

Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. Известно, что охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин – т-РНК – специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.

Охратоксин А обнаружен в кукурузе, ячмене, пшенице, овсе, ячмене. Важен и опасен тот факт, что при высоком загрязнении кормового зерна и комбикормов охратоксин А обнаруживается в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). Охратоксин В встречается редко. Охратоксины также поражают все плоды садово-огородных культур. Особенно сильно поражаются яблоки: до 50% урожая может загрязняться микотоксинами.

Следует отметить, что охратоксины являются стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на 32% (при температуре 250–300ºС). Таким образом, распространненость в продуктах питания, токсичность и устойчивость охратоксинов создают реальную опасность для здоровья человека.

Методы анализа

Охратоксин А содержится в окисленных продуктах. Он легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.

Разработан также метод ВЭЖХ. Перед ВЭЖХ анализом образец готовят следующим образом. Измельченный образец обрабатывают смесью 2 М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 мин. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем и промывают смесью толуола с ацетоном (подвижная фаза). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.

Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но полученные результаты не позволили использовать эти методы для определения охратоксинов.

навливают по одной накладке, а в средней части - две накладки с минимальным шагом между ними, которые указывают на границы набегающей и сбегающей ветвей ленты. Шаг между накладками на набегающей ветви ленты определяется с помощью зависимости арифметической прогрессии, а на сбегающей - по зависимости геометрической прогрессии. При этом первым членом арифметической прогрессии необходимо задаться и учесть, что последний зазор между накладками набегающей ветви ленты является первым членом геометрической прогрессии, а из суммарного зазора между накладками каждой ветви ленты определяется разность и знаменатель прогрессий.

В барабанно-колодочном тормозе выравнивание удельных нагрузок достигается за счет размещения в многосекционной тормозной колодке на ее набегающей и сбегающей части подвижных в радиальном направлении накладок, связанных между собой балансиром, т. е. использован принцип обычных весов. Данное техническое решение защищено авторским свидетельством на изобретение .

Стабилизация поверхностных температур в парах трения вышеотмеченных тормозных устройств достигается за счет термоэлектрического эффекта с применением термобатарей, работающих в режимах термоэлектрохолодильника и термоэлектрогенератора в накладках набегающей и сбегающей ветвей ленты, а также набегающих и сбегающих участках фрикционных накладок колодки в основном и дополнительном сервотормозе в зависимости от теплонагруженности их фрикционных узлов. При этом обеспечивается пе-

рераспределение тепловой энергии между поверхностями фрикционных узлов тормозов, что и ведет к ее квазистабилизации. Работа термобатарей в указанных выше режимах теоретически обоснована.

Рациональное управление режимами эксплуатации ленточно-колодочного тормоза рассматривается при условии, что уровень теплонагруженности поверхностных слоев фрикционных накладок не превышает допустимой температуры для их материалов. Для реализации управления тормозными режимами может быть использовано комбинированное охлаждение (термоэлектрическое с тепловой трубой) пар трения тормоза.

В результате применения данного технического ре -шения было достигнуто повышение эффективности ленточно-колодочного тормоза лебедки У2-5-5.

Таким образом, обозначены пути управления динамической и тепловой нагруженностью фрикционных узлов тормозных устройств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Декларационный пат. 63418А (Украина). Способ управ -ления удельными нагрузками на набегающей и сбегающей ветвях тормозной ленты ленточно-колодочного тормоза / А.И. Вольченко, В.В. Дячук, Н. А. Вольченко и др. - Б.И. - 2004. - № 1. - На укр. яз.

2. А.с. 1682675 А1 СССР. Барабанно-колодочный тормоз / А.И. Вольченко, В.В. Москалев, П.А. Скороход и др. - Б. И. - 1991. -

3. Пат. 2221944 С1 Россия. Системы охлаждения тормозно -го механизма с серводействием и способ ее осуществления / А.И. Вольченко, А. А. Петрик, Н.А. Вольченко и др. - Б.И. - 2004. - № 2.

Кафедра технической механики

Поступила 22.11.04 г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А В ВИНОГРАДНЫХ ВИНАХ

Е.Н. РИКУНОВА, Т.И. ГУГУЧКИНА

Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства

Среди микотоксинов особое место занимают охра-токсины. Они продуцируются некоторыми видами микроскопических плесневых грибов родов Penicillium, Aspergillus, в частности А. ochraceus, P. viridicatum. Эти плесневые грибы встречаются повсеместно, в основном в теплых и влажных условиях, вызывая гниение винограда во время затяжных дождей. Охратоксины обладают общетоксичным действием, поражают почки, печень, снижают продуктивность, обладают эмбриотоксическим, мутагенным и канцерогенным действием.

Международное агентство по изучению рака классифицировало охратоксин как потенциальное канцерогенное вещество и отнесло его к классу опасности 2В. При загрязнении пищевых продуктов охратокси-нами человек заболевает балканской эндемической нефропатией .

В винодельческой продукции ранее находили пату -лин, а в последнее время появилась информация о содержании охратоксинаА . Он загрязняет зерно, овощи, плоды и продукты их переработки, корма, солод, пиво, соки и вино.

Нами разработан способ определения охратоксина в виноградном вине методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Тонкослойная хроматография - разновидность жидкостной хроматографии в плоском с одной стороны слое сорбента, нанесенном на плоскую твердую подложку. Основные особенности ТСХ обусловлены движением элюента (растворителя) по слою сорбента за счет капиллярных сил, что упрощает и облегчает проведение хроматографического процесса. Применение универсального сорбента - силикагеля и открытый слой обеспечивают легкость нанесения пробы, возможность одновременного анализа нескольких проб, простоту наблюдения за процессом элюирования.

Тонкослойная хроматография предусматривает очистку и концентрирование микотоксинов. Для этого используют двумерную или ступенчатую хроматогра-

фию. Первая ступень элюирования - очистка, отделение мешающих определению веществ, вторая ступень - разделение микотоксинов .

Анализ пробы вина методом ТСХ включает стадии подготовок пробы, пластины, хроматографической камеры и элюентов, а также концентрирующего патрона Диапак С16МТ; затем собственно хроматографирование, испарение элюента с пластины, идентификацию, количественную оценку и документирование.

Преимущество метода состоит не только в его простоте, доступности, возможности применения специфических проявляющих агентов, подтверждающих принадлежность вещества к искомому, меньших требованиях, предъявляемых к очистке экстрактов, но и в возможности определения малых количеств охраток-сина - предел обнаружения составляет 0,1 мкг/см3.

Для определения микотоксина охратоксина А в вине и виноматериалах 10 см3 образца пропускают через концентрирующий патрон Диапак С16МТ, концентрируя пробу в 10 раз, и окончательно очищают 1 см3 ацетонитрила. Полученный экстракт в количестве 5 мкл и стандарт наносят на пластины для ТСХ и проводят хроматографическое разделение (элюирование) в подготовленной хроматографической камере с соответствующими элюентами. Самой оптимальной для разделения микотоксина оказалась система растворителей в виде изопропанола и аммиака. Она достаточно летуча и имеет небольшое значение коэффициента удержива-

ния Rf на сорбенте. Пятна микотоксина проявляли, облучая длинноволновым (365 нм) ультрафиолетовым светом. Под действием УФ-лучей пятна микотоксина светятся зелено-голубым светом.

Идентификацию и количественное определение охратоксина проводили методом сканирующей денсометрии на денситометре Сорбфил со специализированной программой обработки результатов анализа и расчета параметров хроматограмм.

Использование денситометра делает метод ТСХ количественным, сопоставимым по разрешающей способности с ВЭЖХ, сохраняя, однако, все преимущества ТСХ.

Предлагаемая методика апробирована на образцах вина с предварительным внесением определенных количеств охратоксина. Метод позволяет быстро и точно контролировать содержание охратоксина в винодельческой продукции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кретова Л.ГЛунев Л. И. Микотоксины. Загрязнение продукции и аналитический контроль. - М.: Агрпрогресс, 2000.

2. Материалы ассамблеи МОВВ. - Париж, 2000. - С. 57-59.

3. Руководство по современной тонкослойной хроматогра -фии / Под ред. О.Г. Ларионова // По материалам школы-семинара по тонкослойной хроматографии. - М., 1994.

Лаборатория технологии виноделия

Поступила 08.09.04 г.

Н.Т. СИЮХОВА

Майкопский государственный технологический университет

В настоящее время серьезное внимание обращено к вопросам загрязнения сельскохозяйственных культур токсичными веществами различной природы, в том числе пестицидами. Среди сельхозкультур, наиболее обрабатываемых химическими средствами защиты от вредителей и болезней, особо выделяется виноградная лоза. Вследствие многократных защитных обработок в каждом вегетационном периоде виноградники уже давно принято считать своего рода аккумуляторами экологически опасных химикатов.

В их число входят фосфорорганические соединения, характеризующиеся повышенной опасностью накопления на обрабатываемых участках и лидирующие по масштабам практического применения. Эти препараты накапливаются в клетках растения. Наиболее опасно и интенсивно ими загрязняются ягоды, что в конечном счете сказывается на качестве и экологической безопасности вырабатываемой из винограда продукции. С учетом высокой токсичности и стабильности фосфорорганических соединений и их метаболитов, определение загрязнения ими виноградной продукции имеет важное научно-практическое значение.

На производственных участках специализированного хозяйства АФ «Фанагория» (Темрюкский р-н) был проведен (1999-2002 гг.) токсикологический контроль винограда красных сортов. Пробы отбирали во время уборки урожая, а анализ продукции на содержание в ней остаточных количеств хлор- и фосфорорганических инсектицидов проводился в аккредитованной испытательной токсикологической лаборатории СКЗНИИСиВ. Принцип выбора виноградных участков для отбора проб основывался на том, что урожай винограда, собранный с них, использовался для заводской переработки и приготовления сухих красных вин в микровинцехе лаборатории переработки винограда СКЗНИИСиВ.

При планировании экспериментов по изучению со -хранения токсичных веществ в винограде учитывалось возможное влияние двух факторов, суммарно определяющих проявление потенциальной опасности поступления инсектицидов в возделываемый виноград: поступление токсичных остатков из почвы насаждений и из самого растения в результате текущих сезонных обработок

ГУ НИИ питания РАМН, Москва

Охратоксин А - вторичный метаболит широко распространенных микроскопических плесневых грибов родов Penicillium (P. verrucosum) и Aspergillius (A. ochraceus) стоит в ряду приоритетных микотоксинов – контаминантов пищевых продуктов, и представляет реальную опасность для здоровья человека. Охратоксин А обладает выраженным нефротоксическим, канцерогененным, а также тератогененным, иммунотоксическим, нейротоксическим, генотоксическим и цитотоксическим действием . Международным агентством по исследованию рака (IARC) охратоксин А отнесен к веществам, возможно канцерогенным для человека (группа 2В) . При введении внутрь LD50 варьирует для разных видов животных от 20-30 мг/кг м. т. (для крыс) до 1 мг/кг м. т. (для свиней) . Охратоксин А рассматривается в качестве одного из этиологических факторов Балканской эндемической нефропатии - тяжелого почечного заболевания, регистрируемого в некоторых восточноевропейских странах (в частности Болгарии, Румынии, Сербии, Хорватии, Боснии и Герцеговине, Словении, Македонии) . Охратоксин А наиболее часто обнаруживается в зерновых продуктах, кофе, специях. В последнее время появляются данные о значительном загрязнении охратоксином А сухофруктов, вина и фруктовых соков. Так, в результате исследований, проведенных в странах ЕС, было установлено, что около 70% партий зерновых продуктов содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00001 до 0,041 мг/кг, около 60% исследованных партий вина были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,000003 до 0,016 мг/л . Особого внимания заслуживают данные о частом обнаружении охратоксина А в крови, а также материнском молоке населения многих европейских стран, что свидетельствует о постоянном поступлении этого микотоксина в организм человека . Основной вклад в величину поступления охратоксина А с продуктами питания вносят зерновые (44%), вино (10%) и кофе (9%) . Рекомендуемое Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) допустимое недельное потребление охратоксина А составляет 100 нг/кг/м. т. . Содержание охратоксина А в странах ЕС регламентируется на уровне 0,005 мг/кг в продовольственном сырье и 0,003 мг/кг в продуктах питания . Достоверные данные о загрязнении пищевых продуктов охратоксином А в РФ отсутствуют.

Разработанный ранее для нужд санитарно-эпидемиологической службы СССР метод определения охратоксина А в пищевых продуктах , использующий жидко-жидкостное распределение для очистки экстракта, имеет ряд недостатков: относительно низкая чувствительность метода (предел обнаружения - 0,001-0,002 мг/кг), значительная продолжительность анализа, а также необходимость использования большого количества хлорсодержащих органических растворителей.

К настоящему времени разработаны новые более эффективные методы определения охратоксина А в пищевых продуктах, основанные на применении твердофазной экстракции (ТФЭ) . Для ТФЭ характерна хорошая очистка экстракта, высокая степень извлечения и малый расход растворителей. При ТФЭ используют нормально-фазовую адсорбционную хроматографию на силикагеле , обращено - фазовую распределительную хроматографию на силикагеле, химически модифицированном октадецилсиланом , иммуноаффинную хроматографию , а также колоночную хроматографию на других сорбентах (диатомитовая земля (целит), полиамид, полимеры, полученные методом импринтинга и др.) .

Слабокислотные свойства (рКА = 4,4) охратоксина А (рис.1) определяют необходимость его экстракции либо в недиссоциированной форме смесями органических растворителей с кислотными водно-солевыми растворами , либо в виде соли - водными слабощелочными растворами, например, раствором гидрокарбоната натрия .

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием является наиболее широко распространенным методом определения охратоксина А в пищевых продуктах .

Целью исследования явилась разработка чувствительного метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах путем оптимизации аналитических подходов, основанных на использовании ТФЭ.

Экспериментальная часть

Аппаратура и реагенты. Хроматографическая система состояла из насоса высокого давления Jasco 880-PU, инжектора Rheodyne-7125 с объёмом петли-дозатора 20 мкл, флуориметрического детектора FL Detector model LC305 (Linear Instruments) (лвозб.=250 нм, лэмис.= 458 нм) и системы для сбора и обработки данных «Мультихром» (Амперсенд). Хроматографическая колонка (250 * 4,6 мм) с неподвижной фазой Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), с размером частиц 5 мкм.

Экстракцию проводили с использованием аппарата для встряхивания shaker s-3.08L (ELMI), для центрифугирования проб использовали центрифугу ЦЛС 31М. Твёрдофазную экстракцию проводили с использованием манифолда Macherey-Nagel, патронов ДИАПАК Силикагель (БиоХимМак СТ), иммуноаффинных колонок (ИАК) OCHRAPREP (R-BIOFARM RHONE LTD). рН растворов измеряли рН-метром МР 230 (Mettler Toledo). Концентрирование проб проводилось на роторном испарителя Laborota 4000 (Heidolph). Для растворения стандартов и упаренных экстрактов использовалась ультразвуковая ванна УЗВ-12л (ПКФ САПФИР). Для подбора оптимальных волн возбуждения и эмиссии использован флуоресцентный спектрофотометр Cary Eclipse (Varian). В качестве стандарта использовался стандартный образец охратоксина А в смеси бензол-уксусная кислота (99:1) с концентрацией С = 9,2 нг/мкл.

Твердофазная экстракция:

Очистка с помощью колоночной хроматографии (КХ) на диатомитовой земле. Экстракцию охратоксина А из 25,0 г. измельченной пробы проводили 125 мл хлороформа после добавления 20 мл 2% уксусной кислоты. Перемешивали на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. 50 мл пропущенного через бумажный фильтр хлороформного экстракта наносили на колонку с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия. Колонку промывали последовательно 70 мл гексана и 30 мл хлороформа. Охратоксин А элюировали с колонки 150 мл смеси бензол – – уксусная кислота (86:12:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 3 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью КХ на силикагеле. Экстракцию охратоксина А из 20,0 г. измельченной пробы проводили 100 мл толуола после последовательного добавления 30 мл 2М раствора соляной кислоты и 50 мл 0,4М раствора хлорида магния. Перемешивали 60 минут, центрифугировали со скоростью 3500 об./мин 5 минут. Верхний толуоловый слой фильтровали через бумажный фильтр, отбирая 50 мл фильтрата. После кондиционирования 10 мл толуола на патрон с силикагелем наносили 50 мл фильтрата, промывали дважды 10 мл н-гексана и 10 мл смеси толуол – ацетон (85:15), затем 5 мл толуола. Охратоксин А элюировали 40 мл смеси толуол – ацетон – уксусная кислота (89:10:1). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью иммуноаффинной КХ . Экстракцию охратоксина А из 50,0г. измельченной пробы проводили 200 мл смеси ацетонитрил – вода (60:40). Перемешивали в течение 30 минут. 4 мл пропущенного через бумажный фильтр экстракта смешивали с 44 мл фосфатного и наносили на иммуноаффинную колонку (ИАК), которую затем промывали 20 мл фосфатного буфера. Остатки фосфатного буфера удаляли продуванием ИАК воздухом. Охратоксин А элюировали 3 мл смеси метанол – уксусная кислота (98:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Условия ВЭЖХ. Идентификацию и количественное определение охратоксина А проводили методом ОФ ВЭЖХ в режиме изократического элюирования с флуоресцентным детектированием (лвозб.=250 нм, лэмис.=458 нм). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. В систему для ВЭЖХ вводилось 20 мкл исследуемого раствора.

Результаты и их обсуждение.

При очистке экстракта путем КХ с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия, в качестве базового был использован метод АОАС 975.38 , предусматривающий применение ТСХ для идентификации и количественного определения охратоксина А. Нами в целях повышения чувствительности и специфичности метода была использована ОФ ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. В результате применения базового метода степень извлечения охратоксина А из матрикса, искусственно контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, в наших условиях не превысила 40%. В целях повышения величины извлечения нами был внесен целый ряд изменений в условия экстракции и очистки: в состав экстрагирующей смеси была добавлена уксусная кислота; объем хлороформа, используемого для промывания колонки, уменьшен до 30 мл; в состав элюирующей смеси внесен ацетон; объем элюирующей смеси увеличен до 150 мл. В результате оптимизации метода величина извлечения охратоксина А из пшеницы возросла до 60% (табл.1).

Степень извлечения удалось существенно повысить, применив метод твердофазной экстракции на патронах с немодифицированным силикагелем (схема, приближенная к методу ICC № 000 ). Корректировка базового метода (увеличено содержание толуола в смеси толуол – ацетон, используемой для промывания колонки, до 85%, в состав элюирующей смеси внесен ацетон, объем элюирующей смеси доведен до 40 мл) позволила увеличить степень извлечения до 80%.

При использовании иммуноаффинной КХ наблюдалась максимальная степень извлечения охратоксина А из пищевого матрикса (до 100%), При этом предел обнаружения (0,0005 мг/кг) был выше, чем при очистке КХ на силикагеле (0,00005 мг/кг).

Для обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А с помощью ВЭЖХ был подобран оптимальный состав подвижной фазы (ПФ) и уточнены длины волн возбуждения и эмиссии флуоресценции, обеспечившие максимальный сигнал и селективность при детектировании охратоксина А (табл.2). Подобранная длина волн возбуждения (250 нм вместо 333 нм) и эмиссии флуоресценции для оптимизированной подвижной фазы позволила повысить отношение сигнал/шум с соответствующим снижением предела обнаружения метода. Изменение состава ПФ позволило улучшить разделение пиков охратоксина А и компонентов матрикса пищевого продукта при одновременном снижении времени удерживания пика охратоксина А (рис.2).

Возможность использования разработанного нами модифицированного метода, основанного на применении патронов с силикагелем, в рутинном анализе охратоксина А была подтверждена выборочным исследованием частоты и уровня загрязнения этим микотоксином основных видов продовольственного сырья. Для этого было изучено продовольственное зерно урожая 2004 года из различных регионов РФ (табл.3). Девять из 46 исследованных образцов зерна содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00005 до 0,005 мг/кг, что не превышало регламенты, принятые в странах ЕС.

Таким образом, путем оптимизации существующих аналитических подходов предложены два варианта метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и оптимизированных условий ВЭЖХ. Метод, основанный на применении КХ на силикагеле, отличается низким пределом обнаружения и невысокой стоимостью расходных материалов. Очистка с помощью иммуноаффинной КХ обеспечивает высокую степень извлечения и чистоту экстракта, а также характеризуется более высоким пределом обнаружения (0,0005 мг/кг вместо 0,00005 мг/кг для варианта с очисткой КХ на силикагеле). Полученные в результате проведенного выборочного исследования содержания охратоксина А в продовольственном сырье данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения загрязнения охратоксином А продуктов питания в целях оценки риска контаминации этим микотоксином пищевых продуктов для здоровья населения РФ.

ГУ НИИ питания РАМН

109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14

I. V. Aksenov, K. I. Eller, V. A. Tutelyan

Optimization of analytical methods for ochratoxin A analysis in food.

Ochratoxin A is a mycotoxin produced by widely distributed Aspergillus and Penicillium species. The mycotoxin is a common contaminant of cereals, coffee, wine, dried fruits and spices. Ochratoxin A has been shown to be nephrotoxc, immunosuppressive, embryotoxic, teratogenic and carcinogenic in many mammalian species. Codex Alimentarius and EC have established maximum permissible level of 5 мg/kg for ochratoxin A in raw cereal grains and of 3 мg/kg – for ready-to-eat products derived from cereals. Two simple and reliable modifications of methods have been developed for the analysis of ochratoxin A in food which are based on immunoaffinity or silica gel column clean-up and HPLC with fluorescence detection. The detection limits were 0,5 мg/kg and 0,05 мg/kg respectively. Methods have been used successfully to analyze ochratoxin A in 46 samples of raw cereals harvested in different regions of Russia. Nine samples were found to be contaminated with ochratoxin A on levels ranged from 0,05 to 5 мg/kg.

Оптимизация аналитических методов обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах.

Охратоксин А – микотоксин, продуцируемый широко распространенными плесневыми грибами родов Aspergillius и Penicillium. Он является частым контаминантом зерновых продуктов, кофе, вина, сухофруктов и специи. Доказано нефротоксическое, иммуносупрессивное, эмбриотоксическое, тератогенное и канцерогенное действие охратоксина А для многих видов млекопитающих. Установленный Кодексом Алиментариус и ЕС максимальный допустимый уровень содержания охратоксина А в зерне равен 5 мкг/кг, в готовых к употреблению зерновых продуктах – 3 мкг/кг. Предложены два оптимизированыx метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Предел обнаружения составил соответственно 0,05 и 0,5 мкг/кг. Разработанные методы использованы для анализа содержания охратоксина А в 46 образцах зерна, собранного в различных регионах России. Девять образцов были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,05 до 5 мкг/кг.

Подписи к рисункам.

Рисунок 1. Химическая структура охратоксина А.

Рисунок 2. Хроматограммы образца пшеницы, контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, при различных способах очистки:

А) КХ на диатомитовой земле Б) КХ на силикагеле В) иммуноаффинная КХ.

Таблица 1. Сравнительная характеристика различных способов очистки экстракта.

Таблица 2. Сравнительная характеристика параметров ВЭЖХ (для 1 нг охратоксина А во вколе).

Таблица 3. Выборочное исследование уровня загрязнения охратоксином А продовольственного зерна урожая 2004 г.

Литература

Грибами - продуцентами охратоксинов - являются грибы родов Aspergillus и Penicillium. Первые сообщения о токсичности для уток продуктов жизнедеятельности гриба A. ochraceus сделаны Скоттом в 1965 г. В последующие годы было проведено большое количество исследований по выделению в чистом виде продуктов жизнедеятельности этого гриба, расшифровке химической структуры выделенных микотоксинов, изучению их биологической активности, условий токсинообразования, методов определения в различных биологических субстратах. Охратоксины были названы по виду гриба - первого продуцента этого микотоксина.

Из культуры гриба A. ochraceus выделено четыре охратоксина -А, В, С и D. Наибольшее санитарно-токсикологическое значение имеет охратоксин А. Он хорошо растворяется в ацетоне, бензоле, ацетонитриле, хлороформе, спиртах. При взаимодействии с железа хлоридом образует окрашенный в красный цвет комплекс, прочные комплексы - с щелочами.

Основные грибы-продуценты охратоксинов - грибы A. ochraceus и P. veridicatum. В странах с теплым климатом корма наиболее часто контаминированы охратоксином гриба A. ochraceus, в странах умеренного климата - гриба P. veridicatum. Оптимальная температура субстрата, при которой идет наибольшее токсинооб-разование при культивировании, для грибов A. ochraceus 28 °С и для грибов P. veridicatum 20 °С.

По данным Н. В. Волкова (1980), из 316 изолятов грибов, выделенных в пяти свиноводческих комплексах Украины, 106 штаммов (33,5 %) были отнесены к грибам A. ochraceus. Из этого количества четыре изолята образовали охратоксин А.

Грибы - продуценты охратоксина А - достаточно часто обнаруживают в кормах в России, однако случаев заболевания животных зарегистрировано очень мало. Это связано с отсутствием чувствительного и специфичного метода определения охратоксина А в кормах. В последнее время охратоксикоз А был установлен в ряде свиноводческих хозяйств Курской и Белгородской областей (Г. П. Кононенко с соавт., 1999).

Охратоксины, так же как и другие микотоксины, сравнительно быстро разрушаются в организме животных. Однако имеются сообщения, что микотоксин в зависимости от дозы может задерживаться в мышечной ткани и в мышцах свиней до 2 нед, в печени до 3 и в почках до 4 нед. Поэтому необходимо установить срок убоя животных после последнего случая поступления микотокси-на в организм в 4 нед. Не исключена также вероятность выделения микотоксина с молоком в случае поступления его в организм с кормами в сравнительно больших количествах.

Охратоксин А относится к высокотоксичным соединениям - ЛД5о для лабораторных животных при однократном введении внутрь 20-28 мг/кг массы животного, для цыплят 7-дневного возраста 11 -15мт/кг. Микотоксин обладает выраженной кумуляцией. Наиболее чувствительны к нему свиньи, особенно молодые, затем птицы.

При содержании микотоксина в кормах 0,2-0,4 мг/кг корма у свиней даже при длительном кормлении не отмечено клинических признаков интоксикации, но замечены снижение прироста массы животных и полиурия. Для цыплят субтоксическая доза составляет 0,6-0,8 мг/кг корма, токсическая - 1,5-2,0 мг/кг. При увеличении содержания охратоксина А в кормах до 5 мг/кг у свиней и цыплят были выражены признаки отравления и гибель отдельных животных.

Токсикодинамика. Недостаточно выяснена. Охратоксин А преимущественно действует на почки, поэтому в Дании, где впервые был зарегистрирован этот микотоксикоз у свиней, его назвали «микотоксическая нефропатия свиней». Установлено, что охратоксины, поступая в кровь, сравнительно быстро связываются с ее белками. Возможно, попадая в кислую среду почек, микотоксин освобождается и проявляет свое нефропати-ческое действие.

Клиника. Хронический охратоксикоз, который чаще бывает в практических условиях, проявляется очень слабо. У животных возрастает жажда, выражены полиурия, снижение прироста массы. В крови в некоторых случаях отмечают лейкоцитоз, увеличение количества лимфоцитов, снижение базофилов. У цыплят наблюдают общее угнетение, взъерошенность перьев, снижение продуктивности. По данным некоторых авторов, на скорлупе яиц появляются желтые пятна.

Лечение. Специфических методов лечения нет. Прежде всего из рациона следует исключить корма, содержащие охратоксин А или же пораженные плесенью. Эффективно введение в корма различных адсорбентов, таких, как цеолиты, глаукониты и др.

Патологоанатомические изменения. Наиболее характерно при охратоксикозе поражение почек. Как правило, они увеличены, капсула местами соединена с корковым слоем. На разрезе корковый слой бледный; под капсулой могут быть кисты размером 1 - 2 мм. При гистологическом исследовании отмечают некроз клеток проксимальных канальцев, разрастание, соединительной ткани в корковом слое.

В брюшной полости иногда находят повышенное содержание жидкости. В отдельных случаях увеличена печень и некротически изменены ее клетки.

Ветсанэкспертиза. При вынужденном убое животных в случае охратоксикоза органы и ткани, и прежде всего почки, необходимо исследовать на присутствие микотоксина. МДУ охратоксина в мясе и субпродуктах не установлен. При обнаружении остатков микотоксина тушу и внутренние органы утилизируют.

Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d), %, Р = 0,95

Стандартное отклонение повторяемости (sr ), %

Предел повторяемости (r ), %

Полнота извлечения веществ, %

4.2 . Вспомогательное оборудование

4.3 . Реактивы и материалы

. Подготовка к выполнению измерений

5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 - 20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3 . Приготовление смесей растворителей

Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1 . Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;

«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;

«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;

«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2 . Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1 . Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2 . Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

. Выполнение измерений

7.1 . Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 . Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

. Обработка результатов измерения

8.1 . Построение градуированной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

Результат анализа представляют в виде (при вероятности Р = 0,95):

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

. Требования к квалификации исполнителя

К выполнению анализа охратоксина А в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

. Условия выполнения измерений

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.